CKS1siRNA联合化疗药物对舌癌Tca8113细胞中CKS1蛋白表达影响的研究



CKS1siRNA联合化疗药物对舌癌Tca8113细胞中CKS1蛋白表达影响的研究

徐亚娟1,李兆东2,高元奇2,张丛笑3,伦志军3,毕崇才3,刘文书3*

(1.吉林省肿瘤医院,吉林 长春130012；2.吉林大学基础医学院,吉林 长春130021；

3.吉林大学第一医院,吉林 长春130021)

舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，治疗效果不理想。目前，舌癌的治疗主要是以手术和放、化疗为主[1]，其中化疗是目前有效综合治疗舌癌的一个重要的方法，但化疗药物的应用存在耐药和毒副作用等，限制了其用量和时间[2,3]。近年来的研究表明[4]，肿瘤的发生、发展是细胞周期调控因子异常导致的细胞周期紊乱，因此，寻找有关的调控因子，并将其作为目的基因与放化疗相结合，对肿瘤治疗具有重要意义。

CKS1是细胞周期蛋白依赖性激酶的亚基，能与其他细胞周期蛋白激酶和磷酸化蛋白结合，参与细胞周期调控，与肿瘤的发生、发展密切相关[5]。现在的研究拟通过CKS1 siRNA转染Tca8113细胞并加用化疗药物，以观察CKS1 siRNA对化疗药物的增效作用。

1材料与方法

1.1　实验材料

人舌癌Tca8113细胞系购自北京博枫科生物科技有限公司，DMEM培养液(上海碧云天生物技术有限公司)。平阳霉素(哈尔滨莱博通药业有限公司)，顺铂(山东罗欣药业股份有限公司)，氟尿嘧啶(修正药业集团股份有限公司)，长春新碱(浙江海正药业股份有限公司)，胰蛋白酶(苏州新宝制药有限公司)。

1.2　实验方法

1.2.1细胞培养人舌癌Tca8113细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5% CO2、37℃细胞培养箱中培养。细胞生长至90%汇合时，用0.25%胰酶(含1% EDTA)消化，经离心后制成单细胞悬液，以1∶4比例传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2CKS1 siRNA 转染CKS1 siRNA有意义链：5’-UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT-3’；对照链：5’-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3’由上海GenePharma公司合成，同时对siRNA序列进行2'Ome修饰(稳定化学结构)和5'FAM修饰(绿色荧光)，具体实验操作严格按GenePharma siRNA-MateTM和siRNA-MateTM转染试剂盒进行。

1.2.3化疗药物对Tca8113细胞的作用将Tca8113细胞培养于96孔板，细胞分为：空白组、转染组、平阳霉素组、顺铂组、氟尿嘧啶组、长春新碱组、平阳霉素+siRNA组、顺铂+siRNA组、氟尿嘧啶+siRNA组、长春新碱+siRNA 组共10组，每组3个复孔。细胞以每孔5×103个接种于96孔培养板，在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养24 h。转染组和转染联合化疗药物组细胞先进行CKS1-siRNA转染，浓度为10 nM；其他各组正常培养。24 h后，药物组分别加入4种药物，具体浓度梯度按表1进行。

表1　4种化疗药物的配制浓度

加药后继续在37℃、5% CO2培养箱中培养48 h，然后每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μl，37℃孵育4 h，弃培养液后再加入150 μl DMSO，震荡10 min，于酶标仪(490 nm波长)测定各孔吸光值(OD值)，计算抑制率并根据公式计算转染前后各组细胞的半致死量(IC50)，同时根据半致死量的值用于后续实验。

1.2.4化疗药物对转染后Tca8113细胞的CKS1蛋白表达水平检测细胞培养及操作方法同前。然后收集细胞，提取蛋白质并对蛋白质进行定量和变性，通过常规SDS-PAGE和Western blot对转染后给予不同化疗药物的Tca8113细胞CKS1蛋白表达进行检测。

2结果

2.1　转染前后4种化疗药物对Tca8113细胞的半数致死量

实验结果如表2所示，转染CKS1 siRNA后，各化疗药物对Tca8113细胞的半致死剂量明显低于未转染组，其中以顺铂组差异更明显。

2.2　转染后4种化疗药物对Tca8113细胞CKS1蛋白表达水平的影响

图像经Imagej软件分析灰度值，进行半定量分析。各组之间的比值差异2倍以上认定为有显著性差异。实验结果如表3、图1所示，转染后再加入4种不同化疗药物的Tca8113细胞CKS1蛋白水平显著下降，与对照和转染siRNA组比较均有显著性差异(P<0.05)，其中，药物联合siRNA协同作用对CKS1蛋白水平影响的强度由弱到强依次为：氟尿嘧啶联合siRNA，平阳霉素联合siRNA，长春新碱联合siRNA，顺铂联合siRNA。

表2　转染前后四种化疗药物对Tca8113细胞的

表3　药物联合siRNA对Tca8113细胞Cks1蛋白水平的影响

—：转染脂质体的对照组； N：转染siRNA组； Cks：Cks1 siRNA转染组；1：顺铂联合siRNA组；

2：平阳霉素联合siRNA组；3：长春新碱联合siRNA组；4.氟尿嘧啶联合siRNA组

图1药物联合siRNA对Tca8113细胞Cks1蛋白水平的影响

3讨论

恶性肿瘤的目前基因治疗有如抑癌基因的附加、癌基因的抑制等[6],但由于肿瘤发病的多基因和多因素等原因，使基因治疗的应用受到限制。因此，将抗肿瘤相关基因与现在治疗方法相结合使其能更好地发挥疗效，是提高化疗药物对舌癌的敏感性的一个重要途径。

2001年Ganoth等[7]首次发现cks1蛋白具有促进p27蛋白泛素化降解功能。P27被认为是一种抑癌基因。此外还具有调节肿瘤的耐药、促进凋亡、诱导分化等作用。张秀梅等[8]应用免疫组化和流式细胞术对肝癌和胃腺癌中的CKS1及CKS1、P27蛋白进行检测，发现在肿瘤中CKS1的表达增高，P27的表达降低，且与淋巴结的转移、浸润程度等有关。最近研究发现[9]，CKS1对细胞周期各个时相G1、S、G2、M期都有作用，其可能促进G2/M期的细胞周期激酶抑制剂P27的集聚。本研究结果提示，转染后细胞的半数致死剂量明显低于转染前，药物联合siRNA转染的Tca8113细胞的CKS1蛋白表达显著下降，表明药物联合siRNA转染可有效抑制CKS1蛋白表达，可能通过防止p27蛋白泛素化降解，抑制肿瘤发展。为应用CKS1 siRNA治疗舌癌的研究提供了进一步实验的证据。

参考文献：

[1]You YH,Chen WL,Wang YP,et al.Reverse facial-submental artery island flap for the reco nstuction of Maxillary defects after cancer abcation[J].J Craniofac Surg,20009,20(6):2217.

[2]张书怡，陈永辉.VDP方案术前诱导化疗治疗舌癌的近期疗效观察[J].齐齐哈尔医学院学报，2011,32(12)：1900.

[3]汪跃平，游云华，梁军，等.顺铂-碘化油悬乳胶液经数字减影血管造影舌动脉栓塞化疗对晚期舌癌的临床病理分析[J].中华临床医师杂志，2010,4(9):1658.

[4]詹启敏，陈杰．细胞周期与肿瘤转化医学[J].中国肿瘤临床，2014,41(1)：1.[5]陈紫萱，黄如欣，张忠英，等.CKS1蛋白在恶性肿瘤中的研究进展[J].检验医学与临床，2009,6(9)：705.

[6]武媛，张壮，潘剑.Rac1基因RNAi慢性病毒载体的构建与鉴定[J].中国组织工程研究，2012,16(20)：3763.

[7]Ganoth D,Boinstein G,Ko T,et al.The cell-cycle regulatory protein cks1 is required for SCF skp2-mediated ubiquitinylation[J].Nat Cell Biol,2001,3(3):321.

[8]张秀梅，顾金松，刘曙，等.老年肝细胞癌中的表达及临床意义[J].中国肿瘤外科杂志，2013,5(4)：239.

[9]Hoellein A,Graf S,Bassermann F,et al.Cks1 promotion of S phaseentry and proliferation is dependent of p27kip1 suppression[J].Mol cell Biol,2012,32(13):2416.

(收稿日期：2015-02-08)

文章编号：1007-4287(2015)07-1054-03

*通讯作者

基金项目:吉林省发展和改革委员会资助(JF2012C006-8)