PPAR-γ在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的表达及与疾病活动度的关系

陈瑞林, 黄文辉, 黄成辉, 陶　怡

(广州医科大学附属第二医院 风湿免疫科, 广东 广州, 510260)

PPAR-γ在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的表达及与疾病活动度的关系

陈瑞林, 黄文辉, 黄成辉, 陶怡

(广州医科大学附属第二医院 风湿免疫科, 广东 广州, 510260)

摘要:目的探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达水平，及与病情活动度的关系。方法选取40例活动期RA患者及40例同期健康体检人群，分别设为RA组和HC组。实时荧光定量PCR法检测PPAR-γ mRNA的表达水平，分析其与病情活动度的关系。结果RA组患者PPAR-γ mRNA表达水平高于HC组，差异有统计学意义(P<0.05)。以DAS28评分为5.1为界分组，DAS28<5.1患者(26例)PBMC中PPAR-γ mRNA的表达高于DAS28≥5.1患者(14例)，差异有统计学意义(P<0.05)。RA组患者PBMC中PPAR-γ mRNA的表达与DAS28-CRP评分呈负相关(r=-0.467, P<0.05)。结论RA患者疾病活动度越低，PPAR-γ越高表达，提示PPAR-γ的表达可能是反映RA疾病活动度的一个有用指标。

关键词:类风湿关节炎; 过氧化物酶体增殖物激活受体γ; 疾病活动度; DAS28评分

类风湿关节炎(RA)是一种以外周多关节慢性炎症及滑膜增生为主要表现，继而发展为关节软骨及软骨下骨破坏的自身免疫性疾病[1]。已有研究显示，关节滑膜巨噬细胞分泌各种细胞因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等，使滑膜处于慢性炎症状态, TNF-α进一步破坏关节软骨和骨，造成关节畸形[2]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在炎症反应中的作用引起了人们的关注。研究[3]表明，激活 PPAR-γ可调控多种基因表达，并产生抗炎作用。前期研究[4]也显示PPAR-γ激动剂吡格列酮可显著抑制胶原诱导性关节炎(CIA)。但少有研究报道外周血中PPAR-γ表达与疾病活动度的关系。因此，本研究通过检测RA患者外周血单个核细胞(PBMC)中PPAR-γ的表达水平，以探讨PPAR-γ在RA发病过程中的可能作用及与病情活动度的关系，进一步阐明RA的发病机制。

1资料与方法

1.1　一般资料

选取2010年9月—2011年1月门诊及住院收治的40例活动期RA患者，设为RA组。均符合美国风湿病学会(ACR)联合欧洲抗风湿并联盟(EULAR)的RA分类标准[5]。其中男5例，女35例；年龄24～65岁，平均50.5岁。活动期同时满足下列条件: ① 4个或以上的关节肿胀; ② 6个或以上的关节触痛; ③ 符合以下任意1条：随访当日晨僵持续时间≥45 min, 血沉(ESR)≥28 mm/h, C反应蛋白(CRP)>10 mg/L。排除标准：有严重心、肝、肾等重要脏器、血液、内分泌系统病变及病史者; 3个月以内接受过生物制剂或关节皮质类固醇治疗；正处于急、慢性感染期间；恶性肿瘤者。同期选取健康体检人群40例，设为HC组。其中男5例，女35例；年龄20～70岁，平均47.2岁。2组间年龄、性别等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2　试剂与仪器

胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)。TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司), SYBR Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒(大连宝生物工程有限公司); PCR引物合成由大连宝生物工程有限公司完成, ABI 7500 Real Time PCR仪(美国ABI公司)，Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司)。

1.3　方法

1.3.1PBMC的制备：抽取清晨空腹静脉血4 mL, 肝素抗凝，Ficoll淋巴细胞分离液分离获得PBMC。

1.3.2荧光定量PCR检测PPAR-γ mRNA的表达：按照TRIzol试剂盒说明，TRIzol Reagent裂解PBMC 提取总RNA，荧光定量PCR方法检测PPAR-γ的mRNA水平，反应按照试剂盒说明采用2步法完成。引物序列分别为: PPAR-γ：上游5′-TGAACGACCAAGTAACTCTCCTC-3′, 下游5′-GCTTTCGCAGGCTCTTTAG-3′，扩增产物片段长度144 bp; GAPDH: 上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′, 下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′, 扩增产物片段长度138 bp; 以GAPDH为内参，反应条件95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s, 40个循环。以cDNA标准品为模板制作标准曲线，按双标准曲线法计算和比较mRNA的相对表达。

1.4　评价标准

采用疾病活动性评分(DAS28-CRP)评估RA患者的活动度/严重度。DAS28-CRP 包括人体28个关节的压痛计数，肿胀计数，CRP的水平以及患者的自身综合评估四个项目，应用公式加以运算。DAS28≥5.1重度活动；DAS28 3.2～<5.1中度活动，DAS28<3.2低度活动；DAS28<2.6病情缓解。

2结果

2.1　2组PPAR-γ mRNA表达水平的比较

RA组患者PBMC中PPAR-γ mRNA表达水平高于HC组，差异有统计学意义(P<0.05), 见图1。以DAS28评分为5.1为界分组，DAS28<5.1患者(26例)PBMC中PPAR-γ mRNA的表达高于HC组及DAS28≥5.1患者(14例)，差异有统计学意义(P<0.05); DAS28≥5.1患者表达高于HC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.2　RA组患者PBMC中PPAR-γ mRNA表达水平与DAS28-CRP评分关系

RA组患者PBMC中PPAR-γ mRNA的表达与DAS28-CRP评分呈负相关(r=-0.467，P<0.05)。见图3。

与HC组比较，*P<0.05

与HC组比较，*P<0.05;

图3RA组患者PBMC中PPAR-γ mRNA表达水平

与DAS28-CRP评分关系

3讨论

PPAR-γ具有抗炎效应，在类风湿关节炎、骨关节炎和其他一些慢性炎症疾病的发病机制起重要作用。在RA动物模型的研究中，发现了PPAR-γ激动剂噻唑烷二酮类药的治疗可减轻滑膜炎症、炎症骨丢失和骨侵蚀[6-8]。PPAR-γ活化对关节炎的保护作用，被Setoguchi等[9]报道的敲除PPAR-γ大鼠模型在胶原诱导刺激下发生的关节炎加重所证实。PPAR-γ激动剂抑制RA滑膜细胞在体外的增殖，并抑制前列腺素E2在RA滑膜成纤维细胞中的合成[10]。在无并发症的系统性红斑狼疮患者中, PPAR-γ激动剂吡格列酮可降低CRP及血清淀粉样蛋白A并改善胰岛素敏感性[11]; 在一项银屑病关节炎开放试验中，吡格列酮能够减少肿胀和压痛关节计数[12]。一项单中心双盲临床试验结果提示，在伴发糖尿病的活动性RA患者中，吡格列酮可改善疾病活动度，但因为缺乏适当的对照组，无法获得一个确定的结论[8]。以上研究结果均支持PPAR-γ激动剂可作为RA辅助治疗，并起到抗炎的重要作用。

但在RA患者体内PPAR-γ的表达水平及其与疾病活动度的相关性却极少报道。由于RA是一种系统性炎症性疾病，其免疫病理事件涉及循环中大部分的淋巴细胞、单核细胞等，且关节内的活化炎症细胞均可由外周激活的细胞池中募集而来。因此，对PBMC的研究可能更能反映患者的整体病理状况。本研究发现RA组患者PBMC中PPAR-γ mRNA表达水平高于HC组(P<0.05)，并与RA患者DAS28-CRP评分呈负相关(r=-0.467,P<0.05), 即在DAS28评分较低的患者中PPAR-γ mRNA的表达水平更高。

参考文献

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[9]Setoguchi K, Misaki Y, Terauchi Y, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma haploinsufficiency enhances B cell proliferative responses and exacerbates experimentally induced arthritis[J]. J Clin Invest, 2001, 108(11): 1667.

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Expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ in peripheral blood mononuclear cells of patients with rheumatoid arthritis and its relationship with disease activity

CHEN Ruilin, HUANG Wenhui, HUANG Chenghui, TAO Yi

(DepartmentofRheumatology,TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedical

University,Guangzhou,Guangdong, 510260 )

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with rheumatoid arthritis (RA) and its relationship with disease activity. MethodsForty active RA patients and 40 healthy participants were assigned to RA group and HC group respectively. The expression of PPAR-γ mRNA was analyzed by real-time quantitative reverse transcription-PCR. ResultsThe level of PPAR-γ mRNA expression was higher in the RA group than that in the HC group (P<0.05). According to score of disease activity in 28 joints (DAS28), the level of PPAR-γ mRNA in PBMC of patients with DAS 28 less than 5.1 (n=26) was significantly higher than that in patients with DAS 28 over than 5.1 (n=14) (P<0.05). There was a negative correlation between expression of PPAR-γ mRNA and outcomes of DAS28. ConclusionThe expression of PPAR- may reflect the disease activity of patients with RA.

KEYWORDS:rheumatoid arthritis; peroxisome proliferator-activated receptor-γ; disease activity; DAS28

通信作者:黄文辉, E-mail: gyhwh@126.com

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11521476); 广东省科技计划项目(2011B031800327)

收稿日期:2014-06-20

中图分类号:R 593.22

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)07-065-03DOI: 10.7619/jcmp.201507018