高产虫草素Cordyceps militaris 菌的诱变育种

曹 照 平，周 广 麒，杨 吉 祥，武 博，金 美 芳，王 亚 芳

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

Cordycepin（虫草素，即3′－脱氧腺苷），又名蛹虫草（Cordycepsmilitaris）菌素，是一种细胞毒性试剂和腺苷的结构类似物［1］，能抑制枯草杆菌、鸟结核杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌等病原菌的生长，尤以对枯草杆菌的抑制作用最强［2－3］。但Cordycepin 在C.militaris中的含量很低，传统的选育方法为原生质体紫外辐射和吖啶橙、亚硝基胍等理化因子诱变［4－6］，新兴的方法有离子注入、近红外光谱法诱变［7］等。李文等［8］利用低能离子束修饰C.militaris菌株提高Cordycepin产量。Das等［9］利用高能离子束辐照方法，筛选得到8－氮鸟嘌呤抗性突变株C.MilitarisG81－3，使发酵液中Cordycepin的产量达到3.1g／L，比出发菌株提高了72%。本研究通过超声波联合硫酸二乙酯（DES）复合诱变C.militaris菌，针对性的筛选黄嘌呤和鸟嘌呤双重营养缺陷型（Xan－＋Gua－）株，其Cordycepin产量与亲株相比明显提高，为Cordycepin的规模化生产提供有力的理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

CordycepsmilitarisFFCC5111，大连工业大学食品发酵微生物菌培养与保藏中心提供。

1.1.2 培养基

基本培养基：硝酸钠3g／L，磷酸氢二钾1g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，氯化钾0.5g／L，蔗糖30g／L，琼脂20g／L，补足水至1 000mL。

活化培养基：葡萄糖40g／L，酵母粉10g／L，Xanthine 0.1g／L，Guanine 0.1g／L，pH 7.0。

发酵培养基Ⅰ：取马铃薯200g→去皮→切碎→加水煮沸→滤液，加入葡萄糖20g，维生素B110mg，加水至1 000mL，pH 自然。固体培养需加入琼脂20g。

发酵培养基Ⅱ：葡萄糖40g／L，酵母粉15g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，K2HPO4·3H2O 0.5g／L，KH2PO40.5g／L，Guanosine 0.1g／L。

补充培养基：在基本培养基中添加Xanthine 100μg／mL和Guanine 100μg／mL，pH 7.0。

1.1.3 试 剂

Xanthine，Guanine，Guanosine，Cordycepin标准品，Sigma公司。

1.1.4 主要仪器和设备

UV－5200紫外分光光度计，旋转蒸发仪，真空冷冻干燥机，MJL07－5超声－微波反应器，MJ33万分之一电子天平，摇瓶／振荡机，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台。

1.2 试验方法

1.2.1 单孢子悬液的制备

将C.MilitarisFFCC5111菌种转接于发酵培养基Ⅰ中，26 ℃、160r／min摇瓶培养6d，无菌过滤，滤取孢子，制备单孢子［10］悬液，无菌生理盐水稀释使孢子浓度为106～107个／mL。

1.2.2C.militaris的诱变

1.2.2.1 超声波诱变条件的确定

超声波功率为200 W，22kHz。将单孢子悬液置于冰水浴中，经过超声波诱变处理60 min后，从中吸取菌液0.1 mL 涂布于完全培养基凝固平板中，26 ℃培养7d，检查培养平板中的单菌落数，计算致死率，并确定超声波诱变的时间。同时做对照试验。

致死率＝（A－B）／A×100%

式中：A为未经超声波诱变的对照平皿中的单菌落数；B为经超声波诱变后平皿中的单菌落数。

1.2.2.2 DES诱变条件的确定

用无菌的磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液，0.1mol／L，pH 7.0），梯度稀释单孢子悬液至10－1，10－2，10－3和10－4倍，分别加入DES溶液使体积分数达到1%，振荡诱变45min。吸取1mL各稀释度诱变菌液至试管中，加入硫代硫酸钠溶液（250g／L）0.5mL 终止反应，再从中吸取0.1 mL 涂布于完全培养基凝固平板上，26 ℃培养到第7 天，检查培养平板中的单菌落数，计算致死率，并确定DES诱变的时间。

1.2.2.3 复合诱变

取稀释度为10－3倍的单孢子悬液8 mL，加入磷酸盐缓冲液和DES溶液，在冰水浴中先后进行超声波和DES 交替复合诱变处理，并从0～60min选择最佳的诱变时间，使得涂于培养平板中基本培养基上的细胞致死率为75%～90%。

1.2.3 营养缺陷型菌株的筛选

1.2.3.1 缺陷型的检出

吸取1mL 诱变液倒入基本培养基中混匀，制成夹层培养基平板（夹层培养基平板共有3层，自下至上依次为不含菌的基本培养基、混有诱变菌液的基本培养基、不含菌的基本培养基）。26 ℃培养后，对首次出现的菌落作标记，然后再向皿内倒入一层（第4层）补充培养基。继续培养后，长出的形态较小的新菌落，即为疑似Xan－和Gua－营养缺陷型突变株［11］。

1.2.3.2 缺陷型的验证

将疑似Xan－和Gua－营养缺陷型突变株依次接种在基本培养基、基本培养基＋Xanthine、基本培养基＋Xanthine＋Guanine上，仅在后者长出的菌就是Xan－和Gua－双重营养缺陷型菌株［12］。

1.2.3.3 高产Cordycepin菌株的获得

作为次生代谢产物的Cordycepin 具有抗菌作用［2－3］。将获得的Xan－＋Gua－双重营养缺陷型突变株接种于发酵培养基Ⅱ中，160r／min、26 ℃摇瓶培养6 d。通过冷冻干燥法制备Cordycepin试样。将指示菌B.subtilis悬液均匀涂于细菌培养基平板上，取10μL Cordycepin样液于直径0.4cm 的滤纸片上，放在指示菌平板上，37 ℃培养过夜，观测各个突变株对B.subtilis生长的抑菌圈，评定Cordycepin的生产能力。

1.2.3.4 复 筛

在100 mL 的发酵培养基Ⅱ中接种10%，160r／min、26 ℃培养16d，期间从第6天开始检测生物量、葡萄糖含质量浓度Cordycepin 生成量，最终选定高产菌株。

1.2.4 Cordycepin的提取及检测

将发酵液4 000r／min离心15min，过滤，清液置于旋转蒸发仪蒸发浓缩，浓缩液加超纯水定容至100mL，待测。

将菌体用蒸馏水反复洗涤，于－50 ℃真空冷冻干燥获得冻干菌体，放入干燥器维持恒重。精确称取0.500g冻干菌溶于10mL 超纯水中，利用超声波提取Cordycepin。提取后10 000r／min离心15min，过滤，取上清液，反复提取2 次，定容至25mL。超声条件：100 W，60 ℃，40min。

将发酵液及冻干菌提取液适当稀释，利用紫外分光光度计测定Cordycepin的含量。

1.2.5 生物量测定

将发酵液4 000r／min离心15min，过滤，蒸馏水反复洗涤，于－50 ℃真空冷冻干燥后，冻干菌体放入干燥器保持恒重，用分析天平称量。

生物量／（g·L－1）＝菌丝体干重／发酵液体积

2 结果与分析

2.1 诱变菌最佳稀释度的确定

将单孢子悬液取稀释度分别为10－1，10－2，10－3，10－4，检验诱变因子超声波和DES 分别对出发菌株C.militarisFFCC5111的影响。如表1所示，当稀释度为10－3时，致死率分别为88.17%和85.47%。通常当微生物致死率在75%～90%时，发生正向突变的概率最高，因此确定10－3为最佳诱变稀释倍数。

表1 诱变因子超声波和DES对菌液稀释倍数的影响Tab.1 Effect of mutagenic factors ultrasound and diethyl sulfate on the germ liquid dilution ratio

2.2 最佳诱变时间的确定

按照“1.2.2”所述的超声波诱变、DES 诱变和复合诱变3种方法，检测处理时间从0～60min对出发菌株致死率的影响。稀释度均取10－3。结果如图1所示。由图1 可知，3 种诱变方案的致死率随作用时间延长而增大，且复合诱变强度要高于单因子诱变强度。当诱变时间达到60min时，诱变因子超声波和DES 作用于单孢子悬液的致死率分别为77.17%和89.76%。而当复合诱变35 和45 min 时，致死率分别为83.33%和88.56%，均比较适合筛选；当60 min时，致死率达到95%。但无论从诱变强度还是诱变效果看，采用超声波联合DES复合诱变均优于单因子诱变。最终选用的最佳复合诱变条件为：1%DES，200 W、22kHz超声强度，处理45min。

图1 不同诱变时间的菌株致死率Fig.1 Strain death rate under different treatment time

2.3 营养缺陷型的筛选

根据“1.2.3.3”所述方法，将获得的Xan－＋Gua－双重营养缺陷型突变株进行摇瓶培养／发酵6d，将菌体冷冻干燥后制备Cordycepin，在指示菌B.subtilis平板上进行抑菌试验，结果见图2。如图2所示，根据“1.2.3”方法筛选鉴定出双营养缺陷型（Xan－＋Gua－）共7株，检测摇瓶培养／发酵至16d时溶液中Cordycepin 的产量，结果见表2。

图2 双营养缺陷型（Xan－＋Gua－）抗菌活性Fig.2 Antibacterial activity of double auxotroph mutant（Xan－＋Gua－）strain

由图2 和表2 可见，发酵16d 时发酵液中Cordycepin产量与在B.subtilis平板上抑菌圈直径结果一致。诱变菌株C.militarisFFCC5111－c的抑菌圈最大，同时生产的Cordycepin 能力较C.militarisFFCC5111提高了约40.2%。

表2 双营养缺陷型（Xan－＋Gua－）突变株和原始菌株Cordycepin产量Tab.2 Cordycepin production of double auxotroph mutant（Xan－＋Gua－）and original strain

2.4 摇瓶培养／发酵过程中生物量和Cordycepin的变化

虫草菌在培养和发酵过程中，生物量将会增长达到几乎恒量，在0～20g／L 葡萄糖含量线性降低，双营养缺陷型（Xan－＋Gua－）突变株C.militarisFFCC5111－c合成Cordycepin 的能力明显提高，见图3、图4。

由图3可知，发酵第6 天，C.militarisFFCC5111菌已进入对数生长期，至第10天生物量达到最高为21.2g／L，然后略有下降，随后基本上维持稳定；而C.militarisFFCC5111－c细胞生长速度略慢于亲株，但其葡萄糖消耗速率大于亲株。比较图4，可能的原因是C.militarisFFCC5111－c的遗传物质发生了改变，合成Cordycepin能力有了明显提升。

原始菌株C.militarisFFCC5111培养／发酵至第16 天，发酵液中Cordycepin 积累量达到2.85g／L；菌体内的积累量则在第10天达到峰值3.124 mg／g。双突变株C.militarisFFCC5111－c的发酵液中Cordycepin不断积累，第16 天达到最大3.995g／L；其在菌体内的积累量6～13d几乎线性增长，第13天达到峰值7.924mg／g，随后略有下降。最高值突变株比出发株分别提高了1.41和2.54倍（图4）。

图3 C.militaris FFCC5111－c和C.militaris FFCC5111发酵过程生物量与葡萄糖消耗变化Fig.3 Biomass and glucose consumption of C.militaris FFCC5111－c and C.militaris FFCC5111in fermentation process

图4 不同发酵时间发酵液和菌丝体Cordycepin的积累变化Fig.4 Cordyceps accumulation of Cordyceps militaris fermentation broth and mycelium at different fermentation time

3 讨论与结论

本研究利用一株生长性状优良的Cordyceps militarisFFCC5111为出发菌株，采用超声波联合DES复合诱变技术，通过抗菌实验初筛、摇瓶培养／发酵复筛，针对性的筛选出双重营养缺陷型菌株（Xan－＋Gua－）C.militarisFFCC5111－c。突变株经过摇瓶培养／发酵至第16 天，C.militarisFFCC5111－c培养／发酵产生的Cordycepin总量为4.142g／L，比亲株提高了44.5%。试验证明，筛选Xanthine和Guanine双重缺陷型突变株是获得Cordycepin高产菌种行之有效的方法之一，同时也验证了Cordycepin的生产与鸟嘌呤是彼此相关的［13］。

Cordycepin提取的方法目前有许多报道，有柱层析法（CCE）［14］、微波法和超声法提取虫草素［15］。但超声提取方法更快捷简便且准确度高，因此采用超声法提取虫草素。本试验采用－40～－50 ℃冷冻干燥法（菌体部分）和减压浓缩法（液体部分）。超声波是频率高于20kHz的声波，穿透能力强，方向性好，可以改变细胞壁膜结构，使细胞内外发生物质交换。硫酸二乙酯（DES）是一种诱变谱较为广泛的烷化剂，能与DNA 中碱基的磷酸部分发生烷化作用，从而引起DNA 复制时碱基配对的转换或颠换。复合诱变因子的使用，可以提高诱变的效率。据试验结果判断，嘌呤核苷酸的代谢途径中IMP→XMP→GMP的代谢支路可能被切断，使代谢前体物质IMP较多地合成腺苷，进一步合成Cordycepin［16］。

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