丙型肝炎病毒体外复制模型的研究进展

马涛综述，蒋孝华审校

（南华大学附属第一医院感染科，湖南衡阳421001）

丙型肝炎病毒体外复制模型的研究进展

马涛综述，蒋孝华审校

（南华大学附属第一医院感染科，湖南衡阳421001）

肝炎，丙型；肝炎病毒；体外研究；细胞模型；综述

持续感染的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一个重要的医学问题。全球有130～170万人感染了这种病菌，感染者发生肝脏损伤的风险很高，包括肝硬化和肝细胞癌[1]。由于丙型肝炎的潜伏期长且大部分病人早期无明显表现，估计在未来的5～10年HCV相关的肝脏疾病患者数量将会持续上涨[2]。迄今为止，未研究出可预防HCV感染的疫苗。然而，在靶向治疗病毒和宿主方面，直接作用的抗病毒药物（direct-acting antiviral drugs，DAAs）取得巨大进步，能有效地阻止HCV的复制[3]。首个抑制HCV非结构蛋白3（NS3）的蛋白酶类抑制剂，增加了感染HCV1型患者的持续病毒应答率，在联合聚乙二醇化的α干扰素/利巴韦林这2种药物治疗的情况下，应答率从45%上升至75%[4]。但是，这三重组合疗法有许多不良反应和一些禁忌证，并仅限于基因型1病毒。因此，更有效的DAAs是必需的。大部分DAAs的发展，都需要有可靠、实用的HCV细胞培养模型。本文对HCV体外细胞模型的研究进展作一综述。

1 HCV的分子生物学特性

HCV是黄病毒科的一员，形成丙型肝炎病毒属。基因组为单股正链RNA，含9 600个核苷酸。它包含1个长开放阅读框和两侧5′和3′非编码区（nontranslated regions，NTRS）。5′非编码区包含1个内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES），可编码约3 000个氨基酸的前体多聚蛋白[5]，翻译后，前体多聚蛋白被宿主信号肽酶和病毒基因编码的蛋白酶切割成10个独立的片段[6]。包括核心蛋白，包膜糖蛋白E1和E2、p7中的离子通道蛋白，非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。核心蛋白是病毒核衣壳的重要组成部分，其作用得到越来越多的关注，最近发现核心蛋白在肝癌的发生中可能直接作为致病因子[7]。高艺[8]认为E1可能与载脂蛋白有关，主要是通过低密度脂蛋白受体得以进入哺乳动物细胞。E1和E2属于膜蛋白，构成病毒外膜。E1、E2与病毒受体发生特异性结合，并介导膜融合与细胞穿入，是引发宿主受病毒感染的始动因素[5]。p7不是病毒复制所必需的，但是在细胞培养系统病毒扩增时是必不可少的蛋白[5]。NS2具有半胱氨酸蛋白酶活性，能切割NS2和NS3的连接位点。NS3在N末端结构域编码丝氨酸蛋白酶，其需要NS4A辅助因子的激活。C端NS3区域编码RNA复制所需的NTPase/解旋酶。NS4B诱导膜重塑，与病毒复制有关。NS5A是一种高度磷酸化的蛋白，参与病毒复制和组装。NS5B是病毒依赖性RNA聚合酶。

2 HCV复制子系统

1999年赵婷等[9]建立了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统，标志着HCV体外培养技术的一大进步。此系统将核心蛋白至p7或核心蛋白至NS2区域的编码用2个非HCV序列替代，即新霉素磷酸转移酶基因（neo）和由脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）衍生的一个额外IRES。由此形成了HCV复制子的双顺反子。将该复制子转染至人肝癌细胞系Huh7，经G418抗性筛选，发现通过敏感的Northern blotting分析很容易检测（一个含有HCV复制子的细胞含有1 000～5 000正链RNAs和10倍以下的负链）[10]。在此基础上，研究者在HCV复制子基因序列中插入适应性突变，发现可以增强复制子的感染与复制能力，但这些适应性突变增强复制的机制仍不清楚[11-12]。

研究主张HCV复制子的自主复制，但仍不能排除一些无意整合进入细胞DNA的病毒序列及因此合成的病毒RNA，这是主要的问题。当发现在放线菌素D（一种DNA依赖的RNA聚合酶强抑制剂）的存在下，病毒RNA能够放射性标记与代谢[3H]尿苷，问题得以解决。因此，第一个可靠实用的HCV亚基因复制子细胞模型成功建立了。然而复制子只能模拟HCV复制，不能产生感染性病毒颗粒。

3 HCV全基因组转染细胞模型

最初，只有少数HCV分离物衍生的复制子可在细胞培养中繁衍，包括CON1、HCV-N和H77株（基因型1）。后来观察到了其他病毒株，如HCV-BK（基因型1b）和J6（基因型2a）[13]。直到Takaji Wakita等从日本1例爆发性肝炎患者的血清中克隆出了一种基因型2a病毒株，命名为JFH-1，在没有适应性突变的情况下能有非常高水平的复制。此病毒株也可以在不易感染的细胞系复制，如HepG2、宫颈癌Hela或293T细胞。JFH-1高效复制的分子机制还没有完全清楚。然而，在Con-1和JFH-1复制子的比较中，确定了更快的JFH-1的负链RNA合成动力学，他们认为这种病毒株能编码更有效的复制酶[14]。用JFH-1全基因组RNA体外转染Huh7细胞，转染24 h后Northern blotting检测到HCV RNA，并在72 h后仍为阳性结果；免疫荧光检测显示，转染后72 h，70%～80%的细胞表达核心蛋白和NS3蛋白，证明该细胞模型能稳定地支持HCV RNA复制[15]。在转染后5 d，检测发现HCV RNA和蛋白的表达达到高峰，并在接下来的7 d中维持在高水平，稍后出现轻微下降。

第一个在非Huh-7细胞如Hela或鼠的肝癌细胞系Hepa-6上成功建立的HCV复制子在2003年被报道，从而证明了HCV RNA复制本身不依赖于仅在人肝细胞表达的宿主因子。通过在这些复制子上使用高效的JFH-1病毒株，可以在许多不同的细胞系如人肝细胞系HepG2和IMY-9、非肝细胞系293和HeLa和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）相当容易地建立起来[16-17]。

可用的易感染细胞克隆系、复制增强的突变和JFH-1株大大拓宽了HCV复制的应用范围。高效含有荧光素酶基因的复制子，适用于瞬时（短期）测定，也是可用的。此外，含有选择性报道基因复制子的细胞株适用于高通量筛选的目的。只含有HCV IRES的单顺反子复制子的构建，更加真实地模仿了病毒基因组的转录属性[18]。最后，NS5A一个位点的发现允许其内部框架插入绿色荧光蛋白（GFP），从而首次允许通过细胞生命成像来进行推定病毒复制位点的研究[19]。

4 HCV体外自然感染模型

HCV转染的细胞模型在细胞内的复制水平较高，但其转染方法操作比较繁杂，需要构建复制子、重组质粒或亚基因复制子才能进行转染。且不能真实反映病毒复制状态。感染模型虽病毒复制水平低，但与自然感染状态最为接近，能够比较真实地模拟HCV感染细胞的状态，比较适于进行HCV发病机制及药物研发等相关研究。

日本东京大学医学院和日本国立卫生研究院的学者认为感染细胞模型的建立必不可少的是HCV阳性血清：（1）血清中HCV的悬浮密度小于1.06 g/mL；（2）抗病毒核心抗体检不出或很低；（3）HCV颗粒对细胞的吸附性好，HCV RNA含量高。

在感染细胞模型的建立中，易感的靶细胞是另一个必不可少的条件，肝细胞是HCV自然感染的细胞，成为建立细胞模型的首选靶细胞。有研究证明人类淋巴细胞Ⅰ型病毒感染的T细胞，人类肝癌细胞系，外周血单个核细胞等都不同程度对HCV敏感。根据研究目的不同，可选择不同的靶细胞。

通过研究表明筛选合适的HCV阳性血清样品，并选择敏感的细胞株作为感染靶细胞，可以建立HCV体外细胞感染模型，在培养上清中能够持续检测到HCV RNA正链的表达，并可间断检测到HCV负链RNA。这可作为综合评价感染细胞模型的指标，也可能被用于抗HCV药物及疫苗研究的评价。近几年，由于感染模型更加贴近于自然感染，已有不少学者成功建立了自然感染模型，但仍需要进一步优化，这将成为未来研究发展的主要方向。

5 肝炎病毒作用的细胞培养系统对药物的发展

亚基因组复制系统在丙型肝炎病毒靶向的DAAs的发展中起着重大作用[20]。（1）它是第一个可用的HCV细胞培养系统，1999年，当复制模式第一次被报道后，HCV的2个关键酶被编码出，NS3蛋白酶和NS5B RdRp，这两种酶能充分显示和高度筛选已确定的候选抑制剂的靶向目标。（2）该复制子概括了细胞内病毒复制循环的步骤。（3）亚基因组复制子包含所有抗病毒治疗的主要目标，也就是，NS3蛋白酶和NS5B RdRp[21]，提供了一个基于细胞的合适的筛选平台。（4）高通量筛查复制子细胞中新的和未知的目标，最显著的是NS5A复制酶因子[22]和宿主细胞编码的亲环A[23-24]。（5）第一个复制子是基于基因型1分离出的，对于以干扰素为基础疗法的研究，这是最普遍和艰难的。（6）亚基因组复制子不支持病毒生产，因此可以在一个没有特殊的生物安全防护的标准细胞培养实验室使用。（7）亚基因组复制子可适应多重筛选格式。例如，含有稳定选择性复制子的细胞系能够表达萤光素酶报道基因，非常适用于细胞化合物的高通量筛选。用于抗病毒药物研发的双重选择性稳定复制子细胞可以提供一种极好的工具，以产生耐药变异体，因为这种方法通常产生的克隆细胞群，能够使其中的抗性突变保守的保留在病毒基因组中。这种方法是必不可少的屏障，以表征某些化合物的阻力，并确定了之后观察到的被治疗患者的主要耐药变异[25-26]。总之，该复制系统一个不可缺少的工具，不仅为DAAs的发展和筛选抗病毒药物，还是对这些药物病毒抗性的表征。

但该复制系统也具有几个明显的缺点：（1）选择性复制子中异源IRES的存在是一个在进行药物筛选时可能的缺陷。（2）在细胞增殖过程中要细心的培养，因为在基于Huh-7系的复制子细胞中的HCV复制非常依赖于宿主细胞的生长。（3）复制增强的突变可能会影响药物靶点的特性。（4）不能排除结构蛋白对给定化合物抗病毒活性的影响。然而，利用基因组复制子，这可以被检测出。（5）缺乏病毒的生产，因而排除了使用该复制系统来筛选影响早期和晚期的病毒复制周期步骤的抑制剂（病毒进入和装配/释放）。

限制了HCVcc的模型在HCV药物研发中的使用有几个原因：（1）基因型2a对于药物的研发是不理想的，因为已经被认可的干扰素/利巴韦林治疗用在这种基因型上，有很高的应答率。许多的DAAs只对某些基因型产生作用，特别是非核苷NS5B抑制剂和第一代蛋白酶抑制剂[39]。事实上，有许多对基因型1b高效的DAAs（第一代），原因可能是基因型1b复制子是最初唯一可用的。（2）与亚基因组复制子相比，感染病毒的工作需要更高的生物安全水平。然而，最近建立的具有复制能力的病毒株和HCVcc模型，覆盖了更广泛的HCV变异体，可能为未来研发针对每个HCV基因型的最佳组合疗法有着重要的作用。

6 展望

丙型肝炎患病率的持续增长，已经成为全球迫切需要解决的公共卫生问题。目前关于丙型肝炎研究大部分以HCV细胞模型为基础。HCV体外细胞培养系统，不仅是DAAs发展必不可少的先决条件，也推动了基础研究。HCV体外自然感染模型需进一步研究改善。

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读者·作者·编者

论文前言的撰写方法

论文前言（亦称引言）是论文的开场白，要求开门见山，简明扼要，介绍论文的写作目的、范围和相关领域研究概况，说明目前研究的热点及存在的问题，引出本文主题，给读者以引导。可简述本研究内容、结果、意义及前景，但切忌写成讨论、综述和回顾，一般要求在200个汉字以内。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.026

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2014-11-19）

马涛（1989-），女，湖南常德人，硕士研究生，主要从事慢性肝病的防治工作；E-mail：308502676@qq.com。

蒋孝华（E-mail：matao5047@163.com）。