人巨细胞病毒感染的实验室诊断技术研究进展

唐华

（第三军医大学大坪医院VIP体检中心，重庆400042）

人巨细胞病毒感染的实验室诊断技术研究进展

唐华

（第三军医大学大坪医院VIP体检中心，重庆400042）

巨细胞病毒/免疫学；巨细胞病毒感染/诊断；抗原，病毒/分析；综述

最近研究结果显示，人巨细胞病毒（HCMV）的感染率在人群当中非常高，流行病学研究数据显示我国为HCMV高发地区，尤其是在经济发展相对滞后地区尤为严重[1]。通过密切接触感染者的体液（尤其是尿液、唾液、血液和生殖器分泌物）在人群中传播[2]，HCMV侵入机体后，将长期或终身存在于人体内。对于绝大多数免疫功能正常的个体来说，常表现为没有临床症状的潜伏感染。对于孕期妇女和儿童，HCMV感染的临床症状较为严重，产前合并HCMV急性感染易导致胎儿流产、早产以及畸形发生率增高[3]。在婴儿出生后3～4周内从婴儿的尿液或唾液中分离出HCMV，是诊断为先天性HCMV感染的“金标准”[4]。对于免疫功能低下者，如器官移植后、骨髓移植后、免疫缺陷患者和采用免疫抑制剂治疗的患者，HCMV的感染是引起其高致死率的重要原因之一。对于造血干细胞移植者，巨细胞病毒感染是术后3个月内最主要的并发症及死亡原因[5]。另有研究表明，HCMV感染与人类动脉粥样硬化以及冠状动脉心脏病的发生也有重要关系[6-7]。目前针对HCMV感染的实验室检查主要集中于器官移植受者、孕妇、新生儿等人群。因此，如何准确、快速和特异性地监测HCMV活动性感染，以指导临床治疗成为了学者研究的关键。

1 HCMV的生物学特点

HCMV是人类疱疹病毒5型（HHV-5），属于疱疹病毒科β亚科，为球形。核衣壳是由162个壳微粒组成的立体对称20面体，双链线性DNA组成了核衣壳内部的病毒基因组核心，而HCMV的核衣壳包含了超过25种病毒编码的蛋白质[8]。HCMV自我复制的周期分为以下3个阶段：即早期、早期和晚期，与之相对应的基因分别为α、β和γ，其表达的产物分别称为即刻早期抗原（IEA）、早期抗原（EA）和晚期抗原。

2 HCMV的检测方法

2.1 病毒培养诊断HCMV感染的“金标准”是体液中分离出巨细胞病毒。研究显示内皮细胞、上皮细胞和人胚肺成纤维细胞是HCMV感染的主要对象[9-10]。而分离的传统方法则是将样本中的病毒接种到例如人胚肺成纤维细胞的敏感细胞中。HCMV感染人胚肺成纤维细胞后一般需要1～3周的时间才会出现典型的细胞病变，阳性结果需要进行免疫学方面的鉴定。而判断为HCMV病毒分离阴性的诊断结果至少需要4周以上的时间，必要时还要进行宣传。由于HCMV增殖速度缓慢，传统的病毒分离方法已达不到早期快速检测HCMV的目的。而改良后的细胞快速培养技术利用了HCMV即刻早期蛋白IE72的单克隆抗体进行免疫荧光实验或酶联免疫实验，来检测细胞中病毒表达的即刻早期蛋白。Alexander等[11]建立了一种新的微量病毒检测技术，即将免疫荧光技术与快速组织培养相结合，先在96孔板中培养人胚肺成纤维细胞，然后向孔中加入处理过的单克隆抗体，接种后3 d就可以检测结果。该方法节约了确诊时间，方便、易行，适合大批量临床标本的检测。

2.2 病毒抗原的检测人体感染HCMV后，即可在外周血白细胞中检测到HCMV抗原。以往使用荧光标记抗体通过免疫组化技术来检测抗原的方法不但耗费时间长而且操作复杂。近年来开展的HCMV抗原血症实验，即检测外周血单个核细胞中的HCMV抗原，用于诊断早期活动性HCMV感染。该实验诊断急性HCMV感染的敏感性和特异性均大于90%，而对于有症状的HCMV感染其敏感性为100%。目前主要检测的是HCMV膜蛋白pUL83（pp65）。它是HCMV感染早期就出现的敏感性标记抗原，其肽序列具有高度的保守性，数量占病毒总蛋白数量的15%。pp65在HCMV活动性感染后2～24 h内就可在血液白细胞当中表达，比病毒核酸出现在血浆中的时间更早，并且在病毒活动期间持续表达[12-13]。患者接受治疗后该蛋白随病毒消失而消失，且蛋白表达量与病毒载体量呈正相关。目前可以用免疫组织化学和流式细胞术对pp65作定性和定量的分析。阮光萍等[14]采用流式的方法对pp65进行了检测，整个操作过程只需要2 h，并且能够定量检测pp65抗原阳性细胞。当免疫抑制剂和抗病毒药物等因素影响了白细胞的数量和功能时，则会影响pp65抗原的检测，所以HCMV pp65抗原血症检测可能不适用于血液移植患者。

2.3 血清学检测

2.3.1 HCMV特异性抗体的检测通过检测血清中的抗HCMV-IgG和IgM来间接检测HCMV的感染情况。如果IgG阳性则说明过去感染过HCMV，而血清转化或连续监测IgG滴度连续升高表明有HCMV活动性感染。在HCMV感染后的1～3个月内血清IgM会维持在一个比较高的水平，所以IgM阳性标志着病毒处于活动期。但是HCMV潜伏感染率高，因免疫抑制而使HCMV被激活引起复发感染时，IgM不一定出现；且移植后免疫功能被免疫抑制剂等药物所抑制，抗体经常延迟产生或短缺，故有HCMV活动性感染时，HCMV IgM检测不一定呈阳性。在临床上常将IgM的检测结果作为判断HCMV近期感染或者活动性感染的依据，将IgG抗体作为HCMV既往感染的指标[15]。如果抗HCMV IgM抗体阳性的同时伴抗HCMV IgG抗体阴性，则表明是HCMV原发性感染。目前用于检测HCMV抗体的方法有放射免疫法、荧光免疫法和ELISA。运用传统的ELISA方法检测HCMV抗体，结果容易被类风湿因子、自身抗体或EB病毒等产生的交叉反应所干扰，造成假阳性结果[16]。目前抗体捕获ELISA应用较多，该方法具有较高的灵敏度和特异性，避免了以上干扰因素，有利于结果的分析、判断[17]。吴福清[18]比较了ELISA和RT-PCR对产前筛查女性巨细胞病毒IgM抗体水平检测的敏感性及特异性，发现后者的敏感性和特异性更高。

2.3.2 抗体亲和力检测对于免疫抑制者，相对于继发感染，原发感染往往伴有明显的临床症状；对于孕妇，孕期中发生的原发感染对胎儿的影响比继发感染更严重。但是检测特异性抗体只能区分有无HCMV感染，而不能区分原发感染、再感染和潜伏-激活感染。研究发现HCMV感染者体内IgG抗体亲和力水平在接触抗原后逐渐升高，因此，IgG抗体亲和力水平可以区别是由于近期病毒感染产生还是既往感染遗留。通过联合检测HCMV特异性IgM抗体和IgG抗体的亲和力，即以检测血清IgM抗体作为初筛，然后对IgM抗体阳性的标本进行IgG抗体亲和力指数的测定，可明确是否发生原发感染[19]。

2.4 HCMV核酸的检测在体液中，HCMV感染后病毒核酸比血清学证据和临床症状出现得更早，因此可将检测HCMV核酸作为HCMV感染的早期诊断指标。HCMV核酸检测的对象主要为DNA和基因转录产物mRNA。HCMV核酸的检测用于HCMV感染的诊断有其独特的优点：既能够检测到未与细胞结合的病毒又可以检测不同的标本，如外周血白细胞、血浆、组织、支气管灌洗液和尿液等；即使延迟处理的标本对检测结果的特异性和敏感性也无明显的影响。

2.4.1 DNA的检测PCR在HCMV感染的实验室诊断中发挥了重要的作用，该技术包括巢式PCR、RT-PCR、捕获探针ELISA-PCR和实时荧光定量PCR（FQ-PCR）等[20]。FQ-PCR技术的问世填补了普通PCR在HCMV潜伏再激活中的研究，大量研究资料证明HCMV DNA的量变与疾病的进展明显相关[21]。FQ-PCR是在PCR的基础上进一步发展起来的高灵敏度核酸定量检测技术。在PCR循环中测量的信号作为荧光阈值（threshold）的坐标，并引入了Ct值（cycle threshold）这个概念。Ct值是指荧光信号被检测到时所需的最小循环数，即在PCR循环中荧光信号由本底进入指数增长阶段这个拐点所对应的循环次数。FQ-PCR的方法有多种，包括SYBR Green、分子信标、FRET探针、Lightcycle技术和Complex探针技术等。大量研究表明，在HCMV病毒感染后1 h就可检出HCMV的IE基因[22]。朱雪娇等[23]使用FQ-PCR检测了50例临床乳汁标本的HCMV IE基因，结果发现整个体系特异性为100%，重复性较好，Ct值变异系数小于5%，整个实验用时也较短，仅需90 min就可一次性完成大批量检测，与临床常用的ELISA方法相比，耗时大大缩短了，操作简单、方便。

2.4.2 mRNA的检测应用PCR检测HCMV DNA时，扩增后产生的大量产物非常容易造成实验室的环境污染，导致假阳性结果。虽然PCR结果阴性对HCMV感染的排除率高[24]，但PCR结果阳性只能证明存在病毒，不能判断病毒是处于活动感染还是潜伏状态，因此要明确诊断需进一步检测RNA。HCMV mRNA的存在是病毒复制与否的标志，通过检测HCMV mRNA可以早期诊断出HCMV活动性感染。将RNA模版的反转录与cDNA的PCR相结合用于检测mRNA可以早期诊断HCMV活动性感染，评价体内病毒复制的状况。另一种检测HCMV mRNA的方法是核酸基础序列扩增技术（NASBA），它是利用硅石依赖的核酸提取术，在恒温条件下直接扩增RNA而不需预先对DNA进行切割和扩增。NASBA整个扩增反应仅由3种酶控制，反应不需要特殊仪器，易实现自动化；而且反应不需要高温变性步骤，不会受到外来双链DNA的污染；可避免常规检测和分析RNA的标准方法中需要大量RNA；反应快、敏感性高、重复性良好[25]。

2.5 生物芯片技术生物芯片是基于微加工技术和微电子技术的微型生化反应平台，不仅用于病毒的抗原和抗体以及核酸的定性和定量检测，还可用于对病毒变异和多种病毒的同步分析。生物芯片可分为4种类型，包括基因芯片（gene chip）、蛋白质芯片（protein chip）、芯片实验室（lab chip）和“大芯片”技术。

2.5.1 基因芯片即在玻片或硅片等支持物上有序而高密度的固定排列了大量靶基因片段或寡聚核苷酸片段（分子探针），将荧光标记样本核酸分子后与固定在支持物上的DNA阵列（DNA micro-array）中的探针进行杂交。通过激光共聚焦显微镜激发和检测杂交后的荧光信号强度，计算和分析样品分子的数量和序列信息，从而可以对基因序列和功能进行大规模，高通量的研究。近年来的研究显示，该技术在病原体检测方面具有较高的特异性和敏感性[26-27]。

2.5.2 蛋白质芯片在生物芯片中，如果点的样品是蛋白质（抗原、抗体或多肽），检测的对象也是蛋白质时，这种芯片称为蛋白质芯片。

2.5.3 芯片实验室即在一块或若干块芯片上完成对蛋白质或核酸的提取、杂交，PCR及电泳等一系列分子生物学操作。芯片实验室使对核酸和蛋白质的检测更加方便、快速和灵敏。

2.5.4 “大芯片”技术以共用探针为基础，同时检测多基因/位点的PCR技术。将被检测的基因或位点的特异性引物置于微孔板上，其设计原理类似基因芯片。

生物芯片的主要优点是：（1）分析过程实现了高度自动化和集成化，大大提高了分析速度；（2）降低了样品和试剂的用量；（3）能够同时处理数个样本；（4）防止污染，有效排除了外界因素对结果的影响。但是目前生物芯片技术的成本过高，仅限于实验室对HCMV的研究工作。

3 小结

HCMV与器官移植受者感染，孕妇的产前诊断和新生儿早期诊断之间有着十分紧密的关系，所以对HCMV检测的研究就显得日益重要起来。多数情况下HCMV感染都属于亚临床感染，没有典型的临床症状，给诊断带来了较大的困难。目前对HCMV的检测多依赖于实验室检测。由于HCMV病毒培养的时间太长，已不适用于临床应用。而免疫抑制剂的使用和“窗口期”的问题使血清学检测缺乏敏感性，在需要区分病毒原发感染和继发感染时并不是理想的检测方法，现多用于患者免疫状态的评估和孕妇的筛查。抗原血症和核酸的检测可反映病毒的活动状态，敏感性和特异性都较高，适合早期诊断HCMV活动性感染。现在针对住院患者多采用抗原血症或者PCR来检测HCMV，同时采用抗原血症检测来对患者进行随访[28-29]。但是HCMV的pp65抗原存在于白细胞中，标本必须在8 h内进行处理，否则检测的敏感性会大大降低；并且在病毒拷贝数低的情况下，可能检测不出pp65抗原[30]。有研究指出，相比于pp65抗原血症分析，用实时PCR技术检测HCMV感染具有更高的敏感性，但对于活动性感染的检测又不如抗原血症分析敏感[31]。目前也有将HCMV DNA的检测与mRNA及血清IgM检测相结合作为对妊娠HCMV感染与垂直传播的评价手段[32]。生物芯片技术是一种新兴的诊断技术，还存在如假阳性率偏高和需要先对检测标本进行聚合酶链反应扩增等缺点，而且检测成本太高，目前还不适合于临床应用。随着研究的深入，更敏感、快速、特异且易标准化的实验室检测技术将在HCMV感染的诊断和治疗中起到更大的作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.024

A

1009-5519（2015）03-0383-04

2014-04-18

2014-09-19）

唐华（1979-），女，重庆万州人，护师，主要从事医院体检方面工作；E-mail：462632936@qq.com。