缺氧诱导因子对肿瘤多药耐药的影响及其靶向治疗的研究进展

刘小微，王松坡

(上海交通大学附属第一人民医院，上海 200080)

缺氧诱导因子对肿瘤多药耐药的影响及其靶向治疗的研究进展

刘小微，王松坡

(上海交通大学附属第一人民医院，上海 200080)

肿瘤多药耐药；缺氧；缺氧诱导因子；靶向治疗；中西医结合疗法

肿瘤的多药耐药(multidrug resistance，MDR)是高效率化疗发展的主要障碍。由于肿瘤组织的结合和肿瘤细胞高效率的糖酵解，许多类型的人类肿瘤细胞都有显著剥夺氧气的特性，这个现象被称为Warburg效应[1]，缺氧是肿瘤细胞的属性。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)作为缺氧应答的全局性调控因子，与肿瘤的多药耐药密切相关。同时，以HIF为靶向治疗的中西医研究具有重要的理论和临床意义，为逆转MDR提供了新策略。

1 肿瘤多药耐药

癌症患者化疗失败的原因多数是由于体内或获得性地产生了对化疗药物的耐药性。这种耐药性是肿瘤细胞对一种化疗药产生耐药性的同时对结构和靶细胞不同的另一些化疗药物产生了交叉耐药性。这种现象被称为MDR[2]。一旦出现MDR，采用更高剂量的化疗药也是无效的，反而会出现进一步诱发的耐药性和药物毒性。MDR产生的机制与多药耐药转运蛋白密切相关，现已发现100余种转运蛋白，如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein，LRP)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)等。它们的特点是具有泵功能的跨膜蛋白的过度表达，使进入肿瘤细胞内的药物被泵排除细胞外，从而减少细胞内的有效药物浓度，以达到肿瘤耐药的目的。

2 HIF

HIF在哺乳动物细胞中广泛表达，它是缺氧应答的全局性调控因子，也是调节肿瘤新生血管生成、能量代谢、细胞增殖、浸润和转移等相关基因的上游转录调节蛋白[3-4]。HIF是由α亚基和β亚基组成的异二聚体，主要包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-β。

2.1 HIF-1α、HIF-2α和HIF-β的结构 HIF-α最早是在Hep3B细胞中被发现的，当时是作为一种能被低氧诱导的具有EPO基因增强子结合活性的核蛋白因子被研究的[5]。以后又观察到该因子对多种低氧反应基因(HRG)的转录都有调控作用,并可能参与对低氧反应信号转导过程，遂命名为HIF-1α。随后，HIF-2α也被发现和克隆[6]。HIF-2α是近年来发现的HIF-1α的蛋白同系物，与HIF-lα 48%的氨基酸序列相同[7]。β亚基又名芳烃受体核转位蛋白(arylhydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)。α亚基和β亚基都含有碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)和PAS(PER-ARNT-SIM)结构，bHLH区是形成HIF二聚体必需的结构，PAs区为DNA结合所必需。HIF-1α由826个氨基酸组成，分子量约为120kD(HIF- 2α 115kD，HIF-β 94kD)。该蛋白N-端(aa.17～299，HIF-2α为14～301)含有基本的螺旋-套-螺旋结构域(basic-helix-loop-he lix domain，bHLH ) (aa.17～70，HIF-2α为14～67) 和一个PAS(Per-ARNT/Abr-Sim)结构域，后者包括PAS-A (aa .106～156，HIF-2α为104～157)和PAS-B(aa .249～299，HIF- 2α为250～301)2个亚结构域。除此之外，α亚基包含有氧依赖性降解结构域(oxygen dependent domain，ODD)，对缺氧刺激产生反应[8]。

2.2 HIF-1α与HIF-2α的功能 研究认为，HIF的功能主要是由α亚基决定的。HIF-1α和HIF-2α虽然在结构上非常相似，但其表达及功能却有很大的差异[9]。近来发现，缺乏HIF-2α的小鼠胚胎肺发育延迟，出生不久死亡是由于肺泡上皮细胞VEGF下降，肺泡表面活性物质减少而死于呼吸窘迫[10]。可见，HIF-2α在功能上有别于HIF-1α，其作用过程似乎主要在器官和胚胎发育阶段。研究表明，识别并结合共同的DNA区域并不足以调节下游基因，氨基末端的相同是两者能调节共同基因的基础，而两者羧基端的不同却导致两者有不同的靶向基因[11]。另外，HIF-1α和HIF-2α能结合的转录因子不同，这也导致了两者能调节的基因不同。后来人们发现HIF-1α能增强其下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖转录因子1(GLUTl)和糖酵解酶等基因的表达，促进血管的生成和细胞能量代谢，影响肿瘤的进展[12-13]。与HIF-1α相似，HIF-2α同样具有核转录活性，两者具有相似的DNA识别位点，即VEGF和EPO等上的“低氧反应元件”(hypoxia-response element，HRE)[14]。然而，HIF-1α和HIF-2α所调节的下游基因却不尽相同。HIF-1α独自调节的基因有糖酵解相关酶类和凋亡相关基因BNIP-3。而胚胎转录因子、转化生长因子α和促红细胞生成素EPO却是由HIF-2α独自调节的。有在研究对人肺腺癌A549细胞株成功进行了缺氧培养，并在多个缺氧时点进行了HIF-α的检测，结果显示，HIF-1α对于急性缺氧环境极为敏感，其表达在4h即至高峰，而HIF-2α在慢性缺氧环境有持续较强表达，可见HIF-1α和HIF-2α在缺氧过程调节中可能各有侧重，即HIF-1α是急性缺氧期的主要反应因子，而HIF-2α则主导慢性缺氧调节[15]。

3 HIF对肿瘤多药耐药的影响

抗癌药物多数进入生长旺盛且血供好的肿瘤细胞群，很少进入缺氧的细胞，并且慢性缺氧的肿瘤细胞远离于大血管，这样缺氧的肿瘤细胞得到的抗癌药物量就少，所以肿瘤细胞在缺氧状态下对化疗药物是不敏感的，因此缺氧可能是导致肿瘤细胞发生耐药性的重要原因[16]。

3.1 HIF-1α与肿瘤多药耐药的关系 HIF-1α是目前研究最多的细胞在低氧环境下发挥重要作用的核转录因子，现针对HIF的研究多数集中在HIF-1α上。HIF-1α参与缺氧介导的肿瘤细胞多药耐药机制主要集中在HIF-1α诱导MDR1/P-gp表达，从而减少化疗药物在肿瘤细胞内的蓄积和抑制化疗药物诱导的细胞凋亡方面[17]。由MDR1基因编码的P-gp与MDR的关系最为密切。Wartenberg等[18]发现，缺氧环境下P-gp和HIF-1α均上调，提示HIF-1α与肿瘤抗放、化疗机制有关。进一步研究发现，MDR1是HIF-1α调控的靶基因。Comerford等[19]通过对人体上皮细胞和内皮细胞在缺氧条件下MDR1/P-gp表达进行分析，证明了缺氧会诱导MDR1/P-gp的表达，并且发现在MDR1启动子-49-45上存在功能性的HIF-1α结合位点(缺氧反应元件)。用反义寡核苷酸阻遏HIF-1α表达，可明显阻遏缺氧诱导的MDRI的表达，甚至完全丧失。研究发现缺氧处理后的人结肠癌细胞LoVo中HIF-1α和 P-gp的表达显著增加，抑制HIF-1α后，MDR1/P-gp mRNA或蛋白的表达不论是在LoVo单层细胞还是MCS中都降低[20]。HIF-1α还会促进肿瘤细胞的凋亡。Erler等[21]发现，在结肠癌细胞、肝细胞瘤、卵巢上皮细胞、肺和胚胎纤维原细胞中，缺氧条件下促凋亡分子Bid呈HIF-l依赖性下调，从而成为细胞存活的原因。Akakura等[22]的研究结果也证实了相似的HIF-1α抗细胞凋亡的机制。他们发现常氧条件下HIF-1α组成性表达的胰腺癌细胞系比无HIF-1α表达的其他细胞系更能抵抗缺氧和无糖所诱导的细胞凋亡。Carmeliet等[23]用低氧处理野生型的胚胎干细胞(ES，HIF - 1α+/+) 和HIF-1α基因失活的胚胎干细胞(ES，HIF-1α-/-)，发现前者细胞增殖减少、细胞凋亡增加，而后者无明显变化；接着对胚胎干细胞来源的肿瘤进行培养，同样发现HIF-1α-/-基因型肿瘤比HIF-1α+/+基因型肿瘤的细胞凋亡少，证明低氧通过HIF-1α诱导细胞发生凋亡 。Piret等[24]研究表明HIF-1α潜在抗凋亡作用，它能够通过使MCL-1蛋白过度表达对抗细胞凋亡。HIF-1α能够下调促凋亡分子的表达是其抗细胞凋亡的机制之一。

3.2 HIF-2α对肿瘤的影响 HIF-2α是今年来新发现的缺氧诱导因子。目前，虽然它与肿瘤相关的研究较少，但已引起国内外肿瘤医学界研究者的广泛重视，相关研究正在不断展开。

MDR和侵袭转移往往是恶性肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。研究表明，HIF-2α与肿瘤侵袭转移显著相关。Imamura等[25]2009年报道了在结肠癌中，HIF-2α表达率下降，而HIF-1α表达率不下降，这与结肠癌进一步发展有很高的相关性。Wang等[26]通过对102块乳腺肿瘤病理组织研究，发现HIF-2α的表达与肿瘤大小、淋巴结转移率显著相关，最重要的是与介导恶性肿瘤侵袭转移的间质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达显著相关。有研究将HIF-2α基因沉默后，HeLa细胞的成瘤性和侵袭力明显下降；HIF-2α基因表达下调可使HeLa细胞的成瘤性比常氧条件下明显降低而细胞侵袭力不受氧因素的影响[27]。进一步观察转染HIF-2α-siRNA后的胃癌SGC7901细胞，可见细胞凋亡率明显上升，淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)表达显著下降，bcl-2相关x蛋白(bax)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的表达显著上升，表明沉默HIF-2α后，能够诱导胃癌细胞凋亡，提示HIF-2α具有抑制胃癌细胞凋亡的作用[28]。

HIF-2α还通过介导相关信号通路来影响肿瘤的增殖。研究发现RNAi沉默HIF-2α表达能够降低乳腺球数量和大小，其机制可能通过HIF-2α介导的干细胞相关信号通路参与对低氧下乳腺球生成的调控[29]。近年研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)与肿瘤耐药性密切相关，VEGF是刺激肿瘤血管生成最主要的因子，在肿瘤的发生发展、浸润及转移中发挥重要作用，对MDR1可能有调节作用。而沉默掉肝癌细胞中的HIF-2α后，VEGF表达下降、肝癌细胞凋亡增强。同时，该研究还证明了肝癌化疗药索拉菲尼会诱导HIF-2α的表达从而阻滞TGF-α/EGFR信号通路的活性，提高耐药性，最终导致化疗的失败[30]。

4 HIF靶向治疗的研究进展

目前，绝大多数对HIF靶向治疗的研究是以HIF-1α为中心的。随着HIF-1α与MDR相关研究的日益深入，以HIF-1α为靶点的中、西医肿瘤治疗方法为克服肿瘤化疗多药耐药提供了新的思路。

4.1 基因靶向治疗 70%的肿瘤中存在HIF-1α过表达现象，HIF-1α的表达与肿瘤血管生成、肿瘤浸润转移密切相关。Rapisarda等[31]用拓扑异构酶I的抑制剂阻止HIF-1α的积累从而达到治疗肿瘤的目的。Stoeltzing等[32]通过构建质粒Phif-1αDNA转入胃癌细胞阻止HIF-1α的作用，使肿瘤生长减慢，阻断HIF-1α表达成为靶向杀伤缺氧肿瘤细胞的重要策略。其机制可能为HIF-1α缺失可导致缺氧诱导的VEGF表达降低，新生血管形成失败，从而延缓实体瘤的生长。Shibata等[33]构建了受缺氧反应启动子调控的硝基还原酶的载体，在缺氧条件下能将无毒性的CBl954转化成毒性形式，在体外和体内实验中都显示出了抗肿瘤的疗效。其机制是研制出对HIF-1α高度反应的启动子，从而启动治疗基因在肿瘤中的特异性表达。利用受缺氧反应启动子调控的前药物转化酶基因，将无毒性的前药转化成对肿瘤有毒性的药物。

4.2 西药制剂 目前进行临床试验的几种新的化疗药的抗肿瘤作用部分可能来自于它们对HIF-1α表达的抑制[34]。如，rapamycin通过抑制serine/theonine激酶FRAP使P13K-AKT-FRAP诱导的HIF-1α表达丧失，从而阻止肿瘤血管的生成和肿瘤转移。在最近的研究中，Kizaka-Kondoh[35]开发了一种融合蛋白药物(PTD-ODD548-603-procaspase-3)，它与放射治疗结合可以显著抑制肿瘤和新生血管的生长。这表明这种融合蛋白是以辐射或缺氧依赖性增加的HIF-1为靶目标，抑制肿瘤中HIF-1依赖因子的表达，如血管生成素和生长因子等。

4.3 中药对HIF-1的影响 中药历史悠久，一直以来在临床治疗中发挥着重要的作用。中药配合放化疗已有数十年，其作用广泛，毒副作用、不良反应少，并取得了较好的治疗效果。目前，中药也逐渐被广泛尝试用于逆转MDR的治疗当中，并且其疗效已得到了大量临床、基础研究的证实。

最近的一项研究表明，中药半枝莲可以抑制肺癌细胞中HIF-1α和VEGF的表达，以及阻滞AKT信号通路的磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的血管生成，最终导致肿瘤活性下降。这项研究表明，中药半枝莲作为一种抗血管生成剂，有逆转MDR的巨大潜力[36]。另一项研究证明，雷公藤能够抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖。虽然雷公藤能够上调HIF-1αmRNA的表达，但是其诱导的HIF-1α蛋白并不具有转录活性[37]，这证明了雷公藤作为逆转MDR药物的可靠性。Vishvakarma等[38]通过对荷瘤小鼠给药，发现姜黄素能够调节溶解在肿瘤细胞中的氧平衡，从而调节HIF-1α的表达水平。此外，姜黄素还能够抑制肿瘤细胞中HIF-1α mRNA、VEGF抗凋亡Bcl-2蛋白的表达。研究发现黄芩素能够通过下调HIF-1α的表达和抑制PI3K/Akt信号通路的糖酵解，来逆转大肠癌的MDR[39]。

5 展 望

HIF和MDR的关系及其机制的研究正日益受到国内外肿瘤医学界的广泛重视。其中，HIF-2α是近几年来发现的最重要的缺氧诱导因子，目前相关研究较少，对其与MDR的关系等更深入的研究正在逐步展开。在逆转MDR的治疗中，中西医联合应用明显提高了许多肿瘤的临床缓解率、生存期及生存质量，并且可降低化疗药的用量和不良反应，优于单纯的化疗药治疗。同时，中药作为逆转MDR的新思路，其机制有待于进一步的实验研究和证实。总之，研发靶向HIF的中、西医新药来逆转肿瘤的多药耐药具有非常广阔的前景。

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2014-10-08