基于无涂层微纳毛细管的流体动力色谱：一种快速分离和分析DNA的新方法

□朱在方，陈 煌，刘绍荣

（俄克拉荷马大学 化学与生物化学系，诺曼 俄克拉荷马 73019）

基于无涂层微纳毛细管的流体动力色谱：一种快速分离和分析DNA的新方法

□朱在方，陈 煌，刘绍荣*

（俄克拉荷马大学 化学与生物化学系，诺曼 俄克拉荷马 73019）

DNA的分离和分析与我们的生活息息相关.在日常生活中，医生正越来越多地用病人的基因信息来诊断疾病，法庭常常用DNA比对的方法来判定嫌疑人是否有罪，疾病控制中心的科研工作者通常会微生物的DNA图谱来判断病原体，所有这些都是基于DNA的分离和分析.目前，分离DNA最常见的方法是凝胶电泳法，该方法分离能力强分离效率高.但是，用于分离的胶的制备耗时耗力，这大大影响了DNA的分离速度.为了解决这一问题，我们首次提出了基于无涂层微纳毛细管的流体动力学色谱的方法.该方法在自由溶液中进行，无需筛分介质或者施加电场，可以实现DNA的快速高效分离.

无胶DNA分离；流体动力色谱；NDA筛分；高通量分析

1 引言

病原菌严重影响着人类健康.大肠杆菌能引起肠道疾病，霍乱弧菌会传染霍乱等等[1].全球每年有超过一亿的志贺氏细菌性痢疾病例[2-4]，致死一百多万，而且多数发生在不发达或发展中国家.对于病原菌引起疫情的有效防治，一个分辨率高且简便高效的分型技术是必不可少的.传统的分型技术主要是根据病原菌的外在生理生化特征，相当耗时[5,6].随着分子生物学的快速发展，多种简便易行的技术逐渐被开发出来.

在过去20多年研究过程中，PCR技术以其高灵敏度、快捷、高特异性的优点，被作为一个强有力的分析技术广泛应用于病原体鉴定[7,8].多重PCR是在常规PCR技术的基础上发展起来的一种新型PCR扩增技术，它可以同时扩增多个特定的DNA片段，大大提高了检测效率，实现多种病原体基因型的鉴定[9,10].通过分离多重PCR产物以及对每个DNA片段大小的定性来实现基因分型.在这个过程中，对于多个DNA片段的分离和大小的定性是至关重要的.目前平板凝胶是最普遍的分离DNA的方法[11,12].但是这种方法每次都需要制造一块凝胶，方法比较费时费力，最大的缺点是它很难实现在病情爆发地点或者犯罪现场实行即时自动化检测.毛细管电泳的方法曾经被用来解决这个问题，但是毛细管电泳每次分离之后都需要更换分离介质来改善重现性，而毛细管电泳本身对PCR反应体系的不兼容性也让这个毛细管电泳方法无法得到广泛应用[13,14].为了解决这个问题，我们开发了一种不需要分离介质，可以反复使用而且容易实现自动化和即时检测的DNA分离方法.

2 方法描述

我们首次提出了基于无涂层微纳毛细管的流体动力色谱方法用于DNA的快速灵敏分离[15-20].该技术在自由溶液中进行，无需筛分介质或者施加电场，可以同时分离长度从75 到106,000 bp范围内的DNA分子.另外，该技术分离效率高，每米的理论塔板数达到百万[21].可以预见该技术将会在很多领域取代凝胶电泳和脉冲场电泳成为DNA分离最有力的工具.

2.1. 仪器装置

如图1所示，用于分离的仪器装置包括细内径的毛细管（microcapillary）、压力舱（pressure chamber）和共聚焦激光诱导荧光检测器（laser-induced fluorescence detector）.毛细管的入口端由聚四氟乙烯隔膜（septum）固定并密封于压力舱分离缓冲溶液中（solution vial），出口端浸于水中以防止毛细管被堵塞.分离所需要的压力由高压氮气罐（He-line）提供，大小由压力调节器来控制和调节.在距离分离毛细管出口约5cm处去掉聚酰亚胺涂层用于检测窗口，该检测窗口被固定在一个可以三维调节的平台上以便于调节检测窗口与激光诱导荧光检测器的相对位置.用于检测的激光诱导荧光检测器由我们实验室设计并搭建.波长488nm的激光束由氩离子激光器（Laser, Spectra-Physics model 263, 25 mW，www.newport.com）发出，经反光镜反射到截至波长为505nm的二向色镜（dichroic mirror, Q505LP, www.chroma.com）上，激光束被二向色镜反射后由透镜（objective, 20×, 0.5 NA, www.rolyn.com）聚焦在毛细管的检测窗口上.样品因受激光诱导而发射的荧光被同一个透镜收集和平行后投射到二向色镜上.因为荧光波长约为520nm，大于二向色镜的截至波长，所以荧光透过二向色镜.然后，荧光由反射镜反射到一个带通滤镜（filter, 535±35 nm, www.omegafilters.com）上，被纯化的荧光再通过透镜（lens）聚焦和小孔空间（pinhole）过滤后照射在光电倍增管（PMT, H5784, Hamamatsu）上.光电倍增光产生的信号由12位的模位转换器采集，最后由实验室编写的Labview程序处理并输出色谱信号.

图1：仪器装置示意图

2.2 理论基础

基于无涂层微纳毛细管的流体动力色谱的分离机理如图2所示.在压力的驱动下，溶液在分离毛细管内流动.根据哈根-泊肃叶定律，分离毛细管内液体的流动为抛物线型流动，因此靠近毛细管壁的液体比毛细管中心的液体具有更大的线性流速.当两种被分离的DNA片段的有效半径分别为p和q，其中p>q.因为长DNA片段不能像短DNA片段那样靠近毛细管壁（R-q≤r≤R），所以长DNA片段更多地分布在毛细管中心且比短DNA片段具有更大的线性流速.这里我们做三个假定：（1）DNA分子行程的颗粒足够小而不至于影响分离毛细管内的层状流动；（2）分离毛细管横截面的各个方向上都存在布朗运动；（3）DNA分子的径向扩散足够快以保证相同片段的每个DNA分子在分离毛细管横截面的分布相同.基于此三个假定，我们可以得出以下公式，

其中u(r)代表分离毛细管内抛物线型流动的速度分布；a代表DNA分子的有效半径；λ=a/R；u代表流动相的平均线性流速；代表DNA分子的相对迁移率.

根据文献报道[22,23]，DNA分子可以被等效为圆形颗粒，其有效的动力学半径为RHD，

其中L代表DNA分子的碱基对书，单位为kbp；v是幂指数；c是系数.用RHD取代公式（1）中的a，可以得到公式（3），

图2：分离机理示意图

2.3 结果与讨论

为了测定DNA分子的相对迁移率，我们先分离一个含有多个DNA片段的样品，每种DNA片段的线性流速由分离毛细管的有效长度除以其迁移时间算得.在相同实验条件下，流动相在分离毛细管中的流速用我们已经报道的方法测得，然后再转化为线性流速.DNA分子的相对迁移率定义为该DNA分子的线性流速与流动相的线性流速之比.

图3： DNA相对迁移率与其大小之间的关系。其中空心圆代表DNA片段在内径1.5 μm的分离毛细管内的相对迁移率

如图3所示，在750 nm内半径的毛细管内测定了10 bp到1.9 Mbp范围内DNA分子的相对迁移率.基于所得到的数据，我们将DNA分为四个区域：棒状区（Rod-Like Region）、无缠绕区（Free-Coiled Region）、等迁移率区（Constant-Mobility Region）和过渡区（Transition Region）.

2.3.1 棒状区

长度小于150 bp的双链DNA性质像分子棒.据Smith等人报道[24]，对这些较小且相对柔韧的DNA分子来说，公式（3）中的幂指数相对较大.为了在这个区域得到幂指数的具体值，我们分析了一个包含10到300 bp范围内13个DNA片段的DNA标准品，色谱图如图4a所示.将所得相对迁移率以最佳适合法拟合公式（3）得到v值为0.728，c值为76 nm*kbp-0.728（见图4b），相关系数为r2=0.9999.v值与文献报道的值（0.68）相比较大[25].这可能是因为我们所测DNA片段比文献中所测片段要短.

图4：较小DNA片段的分离。（a）色谱图。（b）拟合结果。DNA样品的总浓度为60 ng/μL。淋洗液为10 mM TE缓冲（有Tris和EDTA配置而成），其pH值为8。分离毛细管的内径为1.5 μm，总长度为100 cm，有效长度为95 cm。进样为压力进样，进样压力为100 psi，进样时间为10 s。分离压力为500 psi

2.3.2 无缠绕区

当DNA长度从～150 bp提高到2000 bp时，拟合得到的c值基本没有变化，这说明150 bp到2000 bp这一区间是无缠绕区.为了验证这一论断，我们以含有20个150 bp到2000 bp这一区间内的DNA片段的混合物做为样品，色谱图如图5a所示.以最佳适合法拟合公式（3）得到v值为0.5，c值为75 nm*kbp-0.5，相关系数为r2=0.9997（见图5b）.这与文献报道的被标记的DNA的值十分吻合[26].如果我们令v值为0.6，拟合得到的c值为60 nm*kbp-0.6，而相关系数为r2=0.9981（见图5b）.这说明真正的v值应该更接近于0.5而非0.6.如果我们将大于2000 bp的DNA片段包含其中进行拟合，得到的相关系数会下降，这说明无缠绕区是150 bp到2000 bp.

图5：中等长度DNA片段的分离。（a）色谱图。（b）拟合结果。DNA样品的总浓度为60 ng/μL。分离毛细管的内径为1.5 μm，总长度为46 cm，有效长度为42 cm。进样为压力进样，进样压力为100 psi，进样时间为10 s。分离压力为90 psi。其他条件和图4中相同

2.3.3 等迁移率区

大于106 kbp的DNA片段在750 nm内半径的毛细管中无法被分离，因此我们可以认为他们具有相似的迁移率.根据公式RHD=75xL0.5，106 kbp DNA片段的RHD值为772 nm，1.9 Mbp DNA片段的RHD值为3200 nm.若DNA片段无缠绕，其长度将会大于分离毛细管的内径，所以DNA片段会变形为圆柱状以进入分离毛细管.圆柱状的DNA片段会占据分离毛细管的整个横截面.DNA片段长度增加只会增加其形成圆柱的长度而非横截面.因为流体动力色谱是基于分析物在横截面的有效直径进行分离，所以当DNA片段长度大于106 kbp时所有DNA片段具有相似的迁移率而无法被分离.这一区域与凝胶电泳中偏倚爬行区相似[27].

2.3.4 过渡区

介于无缠绕区和等迁移率区之间的区域我们将之定义为过渡区.在这一区域，DNA片段的相对迁移率不能很好地用公式（3）来拟合.原因有以下三点：（1）在狭小地空间里，DNA分子会伸展为圆柱状；（2）DNA分子可以阻塞附件液体的流动；（3）DNA分子的径向运动[28,29].在一根内径较小的毛细管内，DNA分子会发生形变而形成圆柱状.这种效应会使DNA分子的有效半径变小，进而使其相对迁移率降低.当一个DNA分子可以占据分离毛细管横截面的绝大部分时，它们的存在会阻塞毛细管内液体的流动.因为每个DNA分子无论多大都须整体运动，所以大DNA分子的线性流速近似等于毛细管内流动液体的平均线性流速.另外，DNA分子的径向运动会使其更靠近毛细管的中心，进而使其线性流速增加.

综合考虑以上讨论的所有影响因素，我们很难用一个简单的分析模型去解释.不过有趣的是我们发现，如果我们在公式（3）的右边加一个项kL，其中k为常数，实际测得的相对迁移率会更接近公式（3）拟合所得的相对迁移率.为了验证这一论断，我们分析了含有16个75 bp到48.5 kbp范围内DNA片段的样品，色谱图如图6a所示.用修订后的公式（3）的拟合结果如图6b所示，可以看出相关性较好（r2=0.9994）.这说明改进后的公式更适合数据分析.

图6：较大DNA片段的分离。（a）色谱图。（b）拟合结果。DNA样品的总浓度为60 ng/μL。分离毛细管的内径为1.5 μm，总长度为50 cm，有效长度为45 cm。分离压力为100 psi。其他条件与图4中相同

3 应用实例

为了展示该方法的实用性，我们对DNA标准品和实际样品进行了定性和定量分析[30].

我们首先用含有15个DNA的片段的标准品建立荧光信号（峰面积）与DNA浓度之间的关系以用于DNA的定量分析，线性回归方程如图7所示.可以看出，荧光信号与DNA浓度之间线性相关性较好（R2>0.985）.然而，对不同的DNA片段，其回归方程的斜率不同，这可能是不同DNA片段被荧光标记物标记时效率不同造成的.为了解决这一问题，我们用近似法来对DNA进行定量.如果我们想测定长度为bbp的DNA的浓度，我们首先测定其峰面积，然后我们在图7中找到长度为abp和cbp的DNA片段的线性回归方程.这里我们要确保a和c最接近于b并且a＜b＜c.如果长度为abp和cbp的DNA片段的线性回归方程分别为Y=maX和Y=mbX，其中X和Y分别代表DNA的浓度和荧光信号（峰面积），长度为bbp的DNA片段的线性回归方程为，

为了测定某未知DNA的长度，我们首先根据未知峰的迁移时间计算其相对迁移率，然后将相对迁移率代入公式（3）或者修订后的公式（3）来推算未知峰对应DNA的长度.

图7：不同长度的DNA片段的线性回归方程。回归线的相关系数位于0.985–0.991范围之内

用以上描述的方法我们依次对DNA标准品I，λ-DNA酶切产物，串联反复DNA和DNA标准品II做了连续进样分析，色谱图如图8所示.测得的DNA长度和浓度与实际长度和浓度得对比如表1所示，可以看出我们发展得新技术可以快速可靠地对复杂的DNA实际样品进行定性和定量分析.需要指出的是，该技术具有超高的质量灵敏度，可用于单分子水平的DNA分析.

图8：DNA标准品和复杂实际样品的分析。实际样品I和II所含DNA片段和浓度完全相同，总浓度为10 ng/ μL。λ-DNA的浓度为10 ng/μL。串联反复DNA为酵母菌提取物。分离毛细管的内径为1.5 μm，总长度为47 cm，有效长度为41 cm。分离压力为360 psi。其他条件和图4中相同

表1：DNA的定性和定量分析

我们通过十字形玻璃芯片和进样阀实现了毛细管PCR和该技术的在线联用和控制[31].我们还开发了在线标记DNA的方法.用于分离DNA的毛细管先用YOYO-1处理一下，处理完的毛细管可以标记经过它的DNA.处理一次的毛细管最少可以用于40次分离，然后毛细管可以进行再处理，反复使用.图9展示了我们用这整套联用体系对实际样品进行的扩增和分离.

4 前景展望

PCR反应所需要的高盐，大的DNA模板以及酶分子对我们的分离方法不会产生任何影响.我们的DNA分离方法对生物样品有极强的兼容性.随着微流控在生物分析领域的发展，芯片PCR以及微型激光诱导荧光检测器都已经存在了.这些设备如果整合上我们的在线进样，标记以及分离方法，病原体的即时测试方法很可能被开发出来.

图9：多重PCR，DNA分离以及在线标记的微流控平台。A和B 分别是我们方法的分离结果与常规平板凝胶分离的结果。三个不同长度的片段来自于同一个质粒。C和D显示的是基因组片段的扩增结果

[1]Boivin, A.; Corre, L.; Lehoult, Y. Comptes Rendus Des Seances De La Societe De Biologie Et De Ses Filiales 1942, 136, 98-101.

[2]Foerster, M.; Klimpel, S.; Mehlhorn, H.; Sievert, K.; Messler, S.; Pfeffer, K. Parasitology Research 2007, 101, 243-246.

[3]Graczyk, T. K.; Grimes, B. H.; Knight, R.; Da Silva, A. J.; Pieniazek, N. J.; Veal, D. A. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2003, 68, 228-232.

[4]Brandao, S. P.; Brito, M. E.; Carvalho, F. G.; Ishikawa, E. A.; Cupolillo, E.; Floeter-Winter, L.; Shaw, J. J. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2003, 97, 291-296.

[5]Greenberg, D. E.; Porcella, S. F.; Zelazny, A. M.; Virtaneva, K.; Sturdevant, D. E.; Kupko, J. J., III; Barbian, K. D.; Babar, A.; Dorward, D. W.; Holland, S. M. Journal of Bacteriology 2007, 189, 8727-8736.

[6]Lindstedt, B. A. Electrophoresis 2005, 26, 2567-2582.

[7]Shuber, A. P.; Skoletsky, J.; Stern, R.; Handelin, B. L. Human Molecular Genetics 1993, 2, 153-158.

[8]Mutirangura, A.; Greenberg, F.; Butler, M. G.; Malcolm, S.; Nicholls, R. D.; Chakravarti, A.; Ledbetter, D. H. Human Molecular Genetics 1993, 2, 143-151.

[9]Stiller, M.; Knapp, M.; Stenzel, U.; Hofreiter, M.; Meyer, M. Genome Research 2009, 19, 1843-1848.

[10]Hu, X.; Zhang, Y.; Zhou, X.; Xu, B.; Yang, M.; Wang, M.; Zhang, C.; Li, J.; Bai, R.; Xu, W.; Ma, X. Journal of Clinical Microbiology 2012, 50, 288-293.

[11]Tenover, F. C.; Arbeit, R. D.; Goering, R. V.; Mickelsen, P. A.; Murray, B. E.; Persing, D. H.; Swaminathan, B. Journal of Clinical Microbiology 1995, 33, 2233-2239.

[12]Orita, M.; Iwahana, H.; Kanazawa, H.; Hayashi, K.; Sekiya, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1989, 86, 2766-2770.

[13]Lieberwirth, U.; Arden-Jacob, J.; Drexhage, K. H.; Herten, D. P.; Muller, R.; Neumann, M.; Schulz, A.; Siebert, S.; Sagner, G.; Klingel, S.; Sauer, M.; Wolfrum, J. Analytical Chemistry 1998, 70, 4771-4779.

[14]Swerdlow, H.; Gesteland, R. Nucleic Acids Research 1990, 18, 1415-1419.

[15]Wang, X.; Wang, S.; Veerappan, V.; Byun, C. K.; Nguyen, H.; Gendhar, B.; Allen, R. D.; Liu, S. Analytical Chemistry 2008, 80, 5583-5589.

[16]Wang, X.; Veerappan, V.; Cheng, C.; Jiang, X.; Allen, R. D.; Dasgupta, P. K.; Liu, S. Journal of the American Chemical Society 2010, 132, 40-41.

[17]Wang, X.; Liu, L.; Guo, G.; Wang, W.; Liu, S.; Pu, Q.; Dasgupta, P. K. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2012, 35, 122-134.

[18]Wang, X.; Liu, L.; Pu, Q.; Zhu, Z.; Guo, G.; Zhong, H.; Liu, S. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 7400-7405.

[19]Zhu, Z.; Chen, H.; Wang, W.; Morgan, A.; Gu, C.; He, C.; Lu, J. J.; Liu, S. Angewandte Chemie-International Edition 2013, 52, 5612-5616.

[20]Liu, L.; Veerappan, V.; Pu, Q.; Cheng, C.; Wang, X.; Lu, L.; Allen, R. D.; Guo, G. Analytical Chemistry 2014, 86, 729-736.

[21]Zhu, Z.; Liu, L.; Wang, W.; Lu, J. J.; Wang, X.; Liu, S. Chemical Communications 2013, 49, 2897-2899.

[22]Tijssen, R.; Bos, J.; Van Kreveld, M. E. Analytical Chemistry 1986, 58, 3036-3044.

[23]Schaefer, D. W.; Joanny, J. F.; Pincus, P. Macromolecules 1980, 13, 1280-1289.

[24]Smith, D. E.; Perkins, T. T.; Chu, S. Macromolecules 1996, 29, 1372-1373.

[25]Sorlie, S. S.; Pecora, R. Macromolecules 1990, 23, 487-497.

[26]Tegenfeldt, J. O.; Prinz, C.; Cao, H.; Chou, S.; Reisner, W. W.; Riehn, R.; Wang, Y. M.; Cox, E. C.; Sturm, J. C.; Silberzan, P.; Austin, R. H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004, 101, 10979-10983.

[27]Slater, G. W.; Noolandi, J. Biopolymers 1989, 28, 1781-1791.

[28]Shafer, R. H. Biophysical Chemistry 1974, 2, 185-188.

[29]Shafer, R. H.; Laiken, N.; Zimm, B. H. Biophysical Chemistry 1974, 2, 180-184.

[30]Zhu, Z.; Chen, H.; Chen, A.; Lu, J. J.; Liu, S.; Zhao, M. Chemistry – A European Journal 2014, 20, 13821-13821.

[31]Chen, H.; Zhu, Z.; Lu, J. J.; Liu, S. Analytical Chemistry 2015, 87, 1518-1522.

【责任编辑 谢文海】

Bare Narrow Capillary-Hydrodynamic Chromatography: A Novel Technique for Rapid DNA Analysis in A Free Solution

ZHU Zai-fang, CHEN Huang, LIU Shao-rong*
(Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, OK 73019, USA.)

Separation of DNA plays a critical role in our everyday life. Based on DNA analysis, a doctor increasingly uses a patient’s genetic information to diagnose a genetic disease, a court uses the comparison of the DNA of an accused with that found at the crime scene to decide on guilt or innocence, scientists at Centers for Diesease Control use the DNA fingerprint of a microorganism to identify the specific strain of a pathogen, and so forth. DNA molecules are usually separated using gel electrophoresis with high efficiency. However, preparation of gel is time-consuming. To address this problem, we for the first time in the world propose a novel technique, namely bare narrow capillary-hydrodynamic chromatography. This technique is performed in a free solution and novoltage is applied. It can be used for rapid DNA analysis with high efficiency.

gel-free DNA separation; hydrodynamic chromatography; DNA sizing; high-throughput analysis.

[文献标识码]A

1004-4671（2015）05-0002-10

2015-10-01

朱在方（1983～），男，博士，研究方向：分析方法的发展和应用。*

刘绍荣，男，湖北石首人，美国奥克拉荷马大学终身教授。研究方向：纳米通道质量输送研究；大分子分析仪器小型化的研究。