温通活血乳膏对糖尿病周围神经病变大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛水平影响研究

马 静，李凯利，马 丽



·中医·中西医结合研究·

温通活血乳膏对糖尿病周围神经病变大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛水平影响研究

马 静，李凯利，马 丽

目的 探讨温通活血乳膏对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠氧化应激的作用机制。方法 2013年5—9月，选用8周龄雄性SD大鼠50只。采用随机数字表法分为正常对照组10只和造模组40只；造模组大鼠饲养期间死去10只，将剩余大鼠采用随机数字表法分为模型组、硫辛酸组、温通活血乳膏组，各10只。制作DPN大鼠模型，硫辛酸组大鼠腹腔注射硫辛酸，温通活血乳膏组大鼠涂抹温通活血乳膏，正常对照组与模型组大鼠给予等量的基质。检测并比较各组大鼠甩尾时间、潜伏期及运动神经传导速度(MNCV)、血清及坐骨神经抗氧化指标〔超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平〕，观察坐骨神经超微结构。结果 模型组大鼠甩尾时间较正常对照组延长(P<0.05)；硫辛酸组和温通活血乳膏组大鼠甩尾时间较模型组缩短(P<0.05)。模型组潜伏期较正常对照组延长(P<0.05)；温通活血乳膏组潜伏期较模型组缩短(P<0.05)。模型组、硫辛酸组和温通活血乳膏组MNCV较正常对照组缩短(P<0.05)；硫辛酸组和温通活血乳膏组MNCV较模型组延长(P<0.05)。模型组、硫辛酸组和温通活血乳膏组血清MDA较正常对照组升高(P<0.05)。模型组坐骨神经SOD、MDA与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。硫辛酸组和温通活血乳膏组坐骨神经MDA较模型组降低(P<0.05)。模型组有髓神经纤维髓鞘增宽，板层结构破坏严重，神经严重脱髓鞘，细胞器空泡样变性；硫辛酸组、温通活血乳膏组大鼠有髓神经纤维髓鞘、板层结构、施万细胞结构变化较模型组减轻。结论 温通活血乳膏局部用药可以改善MNCV，减轻周围神经结构和功能损伤，其作用机制可能是通过调节氧化还原间的失衡，从而达到治疗DPN的作用。

糖尿病神经病变；超氧化物歧化酶；丙二醛；温通活血乳膏

马静，李凯利，马丽.温通活血乳膏对糖尿病周围神经病变大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛水平影响研究[J].中国全科医学，2015，18(21)：2584-2588.[www.chinagp.net]

Ma J,Li KL,Ma L.Effect of Wen-tong-huo-xue cream on levels of superoxide dismutase(SOD) and methane dicarboxylic aldehyde(MDA) among rats with diabetic peripheral neuropathy[J].Chinese General Practice，2015，18(21)：2584-2588.

糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病最常见的并发症之一，初诊2型糖尿病(T2DM)患者中DPN患者约占34.6%[1]。其临床表现为对称性疼痛、感觉异常、间歇性或持续性发作，可呈电击样、烧灼样疼痛，静止或夜间症状严重，出现难治性溃疡，最终导致截肢。年龄、血糖、血压、糖化血红蛋白、血脂等因素均可影响DPN的发生与进展。但DPN的发病机制尚未彻底阐明，因此尚无特异的治疗措施与根治方案。温通活血乳膏是根据多年临床经验，结合现代医学发病机制的研究，依据“久病多虚”“久病多瘀”的中医理论，以温经通络、活血散瘀、消肿止痛之法，主要用于治疗消渴病引发痹症的外用制剂。本实验从氧化应激的角度探讨温通活血乳膏改善DPN大鼠病变的机制，为临床干预提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠 2013年5—9月，选用健康、清洁级体质量标准(180～220 g)的8周龄雄性SD大鼠50只〔新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2011-0001，动物合格证号：SCXK-LAC2013-5-13〕。

1.2 实验室药品及设备 温通活血乳膏由新疆维吾尔自治区中医医院药剂室提供；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)由美国SIGMA公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 实验分组 50只大鼠检疫观察2周，检疫期结束第2天禁食不禁水12 h后剪尾取血，采用ACCU-CHEK血糖测定仪(瑞士罗氏诊断公司)测定基础血糖，大鼠基础血糖均合格(<6.0 mmol/L)，采用随机数字表法分为两组，正常对照组10只，腹腔注射1%枸橼酸缓冲液(pH 4.2)；造模组40只，腹腔注射60 mg/kg STZ(溶于1%枸橼酸缓冲液，pH 4.2)。72 h后大鼠剪尾取血，测定尾静脉血糖水平，以血糖≥16.7 mmol/L作为糖尿病大鼠成模标准。成模的糖尿病大鼠(40只)继续饲养11周，制成DPN大鼠模型[1]，期间死去10只大鼠。

采用随机数字表法将成模的DPN大鼠(30只)分为3组，

本研究背景：

氧化应激在糖尿病周围神经病变的发生发展中的作用是目前学者研究的热点，而中医药对此研究甚少。

每组10只，分别为模型组、硫辛酸组、温通活血乳膏组。硫辛酸组大鼠腹腔注射硫辛酸，25 mg/kg[2]；温通活血乳膏组大鼠两后肢剃毛(剃毛面积均为1.6 cm×1.6 cm)后涂抹温通活血乳膏，0.4 g/只，并使用老鼠颈圈将头部固定，4 h后使用温水将温通活血乳膏擦去。正常对照组与模型组大鼠两后肢剃毛(剃毛面积均为1.6 cm×1.6 cm)后涂抹等量的基质，方法同温通活血乳膏组。连续给药8周，1次/d。

实验过程中，大鼠共死去16只，最终正常对照组10只，模型组8只，硫辛酸组8只，温通活血乳膏组8只。本研究由新疆维吾尔自治区药物研究所实验动物伦理委员会审核通过。

1.4 研究方法

1.4.1 检测甩尾时间 给药后8周，将4～5 cm长的大鼠尾端浸入(52.5±0.5)℃的水中，测定鼠尾从浸入到完全离开水面的时间，即甩尾时间，连续测3次，2次间隔5 min，取平均值[3]。

1.4.2 检测潜伏期及运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity，MNCV) 将大鼠麻醉，俯卧位固定。(1)计算潜伏期：刺激电极置于神经干，记录电极置于肌腹，参考电极置于肌腱；地线置于刺激电极和记录电极之间。用单脉冲方波刺激，波宽0.1 ms，刺激强度1.5倍阈值，计算机记录从刺激神经开始到远端肌肉出现动作电位的时间，即潜伏期。在动物体表准确测定刺激电极到记录电极之间的距离。(2)计算MNCV：超强刺激神经干远端和近端，在该神经支配的肌肉上可记录到2次复合肌肉动作电位(compound muscle action potential，CMAP)，测定其不同的潜伏期，用远端和近端之间的距离除以两点间潜伏期差，即为MNCV。

1.4.3 检测血清及坐骨神经抗氧化指标

1.4.3.1 检测血清SOD、MDA水平 给药后8周，眼内眦静脉取血，2 500 r/min离心10 min(离心半径为64 mm)，取上清液，采用SOD、MDA测定试剂盒检测SOD、MDA水平。

1.4.3.2 检测坐骨神经SOD、MDA水平 给药后8周，取下坐骨神经，加入0.9%氯化钠溶液，制成5%的匀浆，2 500 r/min离心10 min(离心半径为5 cm)，取上清液，再用0.9%氯化钠溶液1∶1稀释成2.5%组织匀浆后，按照SOD、MDA测定试剂盒说明书检测SOD、MDA水平。

1.4.4 观察坐骨神经超微结构 用戊二醛固定坐骨神经，制作电镜切片，观察坐骨神经超微结构。

2 结果

2.1 甩尾时间比较 4组大鼠甩尾时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠甩尾时间较正常对照组延长，差异有统计学意义(P<0.05)；硫辛酸组和温通活血乳膏组大鼠甩尾时间较模型组缩短，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 潜伏期、MNCV比较 4组大鼠潜伏期、MNCV比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组潜伏期较正常对照组延长，差异有统计学意义(P<0.05)；温通活血乳膏组潜伏期较模型组缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、硫辛酸组和温通活血乳膏组MNCV较正常对照组缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；硫辛酸组和温通活血乳膏组MNCV较模型组延长，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1 Comparison of tail flick latency,latency and MNCV of rats among different groups

组别只数甩尾时间(s)潜伏期(ms)MNCV(m/s)正常对照组104.2±1.11.2±0.234.3±2.6模型组810.1±3.3a1.7±0.2a17.7±1.9a硫辛酸组86.2±1.2b1.5±0.323.7±3.8ab温通活血乳膏组86.1±2.1b1.3±0.3b21.8±4.5abF/Z值20.063c6.81842.975P值<0.0010.001<0.001

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；c为Z值；MNCV=运动神经传导速度

2.3 血清及坐骨神经抗氧化指标比较 4组大鼠血清SOD比较，差异无统计学意义(P>0.05)。4组大鼠血清MDA比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组、硫辛酸组和温通活血乳膏组血清MDA较正常对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。4组大鼠坐骨神经SOD、MDA比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组坐骨神经SOD、MDA与正常

本研究创新点：

目前临床尚无中药外用乳膏治疗糖尿病周围神经病变的药物，本研究旨在从氧化应激角度及形态学角度探讨温通活血乳膏改善糖尿病周围神经病变的机制，为临床及研制新药制剂提供理论基础。

对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；硫辛酸组和温通活血乳膏组坐骨神经MDA较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table 2 Comparison of levels of antioxidant markers in serum and sciatic nerve of rats among different groups

组别只数血清SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)坐骨神经SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)正常对照组10141.1±19.25.4±1.032.2±5.25.6±1.1模型组8123.8±11.57.9±1.9a24.8±1.6a7.5±1.5a硫辛酸组8124.4±13.76.7±0.9a30.0±5.65.5±1.2b温通活血乳膏组8131.9±23.07.1±1.1a28.8±4.36.2±0.8bF/Z值1.9246.39911.833c5.109P值0.1470.0020.0080.006

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05；c为Z值；SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛

2.4 坐骨神经超微结构比较 正常对照组：有髓神经纤维髓鞘致密、均匀，髓鞘板层呈同心圆状排列，轴突内神经和神经微管排列整齐，施万细胞及无髓纤维均正常。模型组：有髓神经纤维髓鞘增宽，结构松散，排列紊乱，板层结构破坏严重，神经严重脱髓鞘，细胞器空泡样变性。硫辛酸组：有髓神经纤维髓鞘板层结构出现低密度泡状结构，少量神经表现脱髓鞘，施万细胞结构变化不明显。温通活血乳膏组：有髓神经纤维髓鞘板层结构出现低密度泡状结构，神经处于脱髓鞘的各期，施万细胞结构变化不明显(见图1)。

3 讨论

DPN是糖尿病常见的慢性并发症，是造成糖尿病足及截肢的主要原因。其发病原因尚未完全阐明，目前认为氧化应激与糖尿病慢性并发症的发生发展关系密切，而抗氧化剂已被用于糖尿病慢性并发症的治疗[4]。

通过阅读古今文献，结合大量DPN 患者的临床观察，认为本病是消渴病日久，久病入络而引起的神经并发症；温通活血乳膏是根据多年临床经验，结合现代医学发病机制的研究，依据“久病多虚”“久病多瘀”的中医理论，以温经通络、活血散瘀、消肿止痛之法，主要用于治疗消渴病引发痹症的外用制剂[5]。有文献报道，川芎、红花、桂枝、白芷、地龙的提取物均有抗氧化作用[6-12]。本实验从氧化应激的角度，探讨温通活血乳膏改善DPN大鼠病变的机制。

注：A为空白对照组，B为模型组，C为硫辛酸组，D为温通活血乳膏组

图1 各组大鼠坐骨神经超微结构(免疫组化染色，×10 000)

Figure 1 The sciatic nerve ultrastructure of different groups for rats

本研究结果显示，模型组MNCV较正常对照组减慢，表明DPN大鼠模型造模成功。与模型组比较，硫辛酸组、温通活血乳膏组MNCV增快，潜伏期、甩尾时间缩短，坐骨神经的超微结构明显改善，说明温通活血乳膏对DPN大鼠有治疗作用。模型组大鼠坐骨神经SOD水平较正常对照组下降，MDA水平较正常对照组升高，说明了氧化应激的产生且在坐骨神经组织中有所表现。硫辛酸组、温通活血乳膏组坐骨神经MDA水平较模型组降低，提示通过温通活血乳膏的干预后，可降低坐骨神经组织中MDA水平，证明温通活血乳膏可以通过抗氧化还原作用降低脂质过氧化，从而对DPN大鼠MNCV的减慢具有改善作用。透射电子显微镜观察到，温通活血乳膏组大鼠有髓神经纤维髓鞘板层结构、施万细胞结构变化较模型组均减轻，证明温通活血乳膏能减轻DPN大鼠周围神经损伤，延缓DPN进程。

然而，慢性持续性高血糖会导致过高的糖化反应和氧化应激的形成[13]，温通活血乳膏对DPN大鼠血糖无直接影响[14]，持续的高血糖使机体处于氧化应激状态，可能导致各项指标的变化不明显。中医药在DPN治疗中缺乏大样本量、长期前瞻性、回顾性研究的相关临床研究，循证依据不充分。与中医病因及辩证分型相对应的动物模型没有统一的构建标准与模式，因此，构建符合中医病因/辨证分型、分期的动物模型，在探讨中医药防治DPN研究中至关重要。另外，由于时间、经费等原因，本研究尚存在观察例数较少的局限性。今后需进一步扩大临床观察范围，以获得更有说服力的证据。

综上所述，温通活血乳膏局部用药可以通过抗氧化应激和调节氧化还原间的失衡而改善MNCV，减轻周围神经结构和功能损伤，从而起到治疗DPN的作用。

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(本文编辑：崔丽红)

Effect of Wen-tong-huo-xue Cream on Levels of Superoxide Dismutase(SOD) and Methane Dicarboxylic Aldehyde(MDA) Among Rats With Diabetic Peripheral Neuropathy

MAJing,LIKai-li,MALi.

DepartmentofEndocrinology,XinjiangUygurAutonomousRegionHospitalofTraditionalChineseMedicine,Urumqi830000,China

Objective To observe the mechanism of the effect of Wen-tong-huo-xue cream on oxidative stress among rats with diabetic peripheral neuropathy(DPN).Methods 50 male SD rats of 8 weeks old were selected as study subjects from May to September in 2013.The rats were divided into normal control group (n=10) and building model group (n=40) by random number table method. 10 rats of building model group died during the study, and then the rest rats were equally divided into three groups: model group, lipoic acid group, and Wen-tong-huo-xue cream group by random number table method.Rats in lipoic acid group were injected intraperitoneally with lipoic acid,rats in Wen-tong-huo-xue cream group were bepainted with Wen-tong-huo-xue cream,rats in normal control group and model group were treated with the same amount of matrix.The tail flick latency,latency,motor nerve conduction velocity(MNCV),levels of antioxidant markers〔superoxide dismutase(SOD) and methane dicarboxylic aldehyde(MDA)〕 in serum and sciatic nerve were measured and compared among different groups of rats,the ultra microstructure of sciatic nerve was observed.Results The tail flick latency of rats in model group was significantly longer than that of rats in normal control group(P<0.05);while the tail flick latency of rats in Wen-tong-huo-xue cream group and lipoic acid group was significantly shorter than that of rats in model group,respectively(P<0.05).The latency of rats in model group was significantly longer than that of rats in normal control group(P<0.05);the latency of rats in Wen-tong-huo-xue cream group was significantly shorter than that of rats in model group(P<0.05).MNCV of rats in model group,lipoic acid group,and Wen-tong-huo-xue group was significantly shorter than that of rats in normal control group,respectively(allP<0.05);MNCV of rats in lipoic acid group and Wen-tong-huo-xue group was significantly longer than that of rats in model group,respectively(P<0.05).Serum level of MDA of rats in model group,lipoic acid group,and Wen-tong-huo-xue group was significantly higher than that of rats in normal control group,respectively(P<0.05).There were significant differences in levels of SOD and MDA in sciatic nerve between model group and normal control group(P<0.05).There was significant difference in sciatic nerve MDA level between lipoic acid group and model group(P<0.05),and there was significant difference in sciatic nerve MDA level between Wen-tong-huo-xue group and model group(P<0.05).Widened myelin sheath of spinal nerve,damaged lamellar structure,demyelination of nerves,and organelle vesicular degeneration were found among rats in model group;the structural changes of myelin sheath of spinal nerve,lamellar structure,and Schwann cells among rats in Wen-tong-huo-xue cream group and lipoic acid group were slighter than those among rats in model group.Conclusion Wen-tong-huo-xue cream can improve MNCV,alleviate the injury of peripheral nerve structure and function,and its mechanism might be related to adjusting the imbalance between oxidation and reduction,so as to achieve the goal of treating DPN.

Diabetic neuropathies;Superoxide dismutase;Malondialdehyde;Wen-tong-huo-xue cream

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2012211A095)

830000新疆乌鲁木齐市，新疆维吾尔自治区中医医院内分泌科

李凯利，830000新疆乌鲁木齐市，新疆维吾尔自治区中医医院内分泌科；E-mail：easd04lkl@126.com

R 587.29

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.020

2014-08-24；

2015-01-03)