五味子种子木脂素超声提取工艺的优化

张悦怡，赵 岩，刘勇慧，温 馨，程 铭，盛彦玲，杨 鹤，刘双利，张连学

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)

五味子种子木脂素超声提取工艺的优化

张悦怡，赵 岩，刘勇慧，温 馨，程 铭，盛彦玲，杨 鹤，刘双利，张连学

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)

【目的】 研究乙醇体积分数、超声时间、液固比及其交互作用对五味子种子木脂素提取率的影响，并优化其提取工艺。【方法】 以木脂素提取率为考察指标，选取乙醇体积分数、超声波提取时间和液固比为因素，进行单因素试验；然后在单因素试验基础上确定因素和水平进行中心组合设计试验，应用SAS 9.1软件和响应面分析相结合的方法，模拟木脂素提取率回归方程的预测模型，验证优化得到的最佳提取条件。【结果】 五味子种子木脂素的优化提取工艺为：乙醇体积分数73%，超声时间32 min，液固比299 mL/g。在此条件下，经过多次验证试验，发现木脂素提取率为2.47%，与理论值(2.59%)十分接近。【结论】 利用中心组合设计试验优化获得了五味子种子木脂素的超声提取工艺，为其工业化提取提供了参考。

五味子；木脂素；提取工艺；中心组合设计；响应面分析

五味子为木兰科植物五味子(Schisandrachinesnsis)的干燥成熟果实，俗称北五味子，其味酸甘、性温，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效[1]。现代药理研究表明，五味子有保肝益肾、保护心脑血管、镇痛、镇静、催眠、抗衰老、抗肿瘤、降血糖及免疫增强作用[2-3]。大量研究证明，五味子中含有的联苯环辛二烯结构的木脂素类物质是其主要的生物活性成分，主要包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素等[4]，其中含量较高的是五味子醇甲和五味子乙素[5]，此类物质具有保肝、降酶、保护中枢神经系统、抗艾滋病毒和抗癌等多种活性[6-11]。

目前，关于五味子木脂素的提取研究，多是以整个果实作为提取原料[12-16]，但五味子果实不同部位(果肉、种子)所含化学成分有别，导致其用途不同，如其果肉主要有效成分以有机酸、多酚类物质为主，而种子以木脂素类成分为主；果肉可以用作饮品的生产原料，种子则可以用作木脂素类成分生产的原料[6]。所以，本研究将成熟五味子果肉与种子分离，仅以其种子为原料提取木脂素类成分，考察不同因素对木脂素类成分提取率的影响，并采用中心组合设计-响应面分析法对其超声提取工艺进行优化，以期提供一种高效、安全、无有毒溶剂残留的五味子木脂素提取工艺，为五味子木脂素类物质的工业化提取提供支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试五味子购于当地药材市场，经吉林农业大学张连学教授鉴定为木兰科植物五味子的成熟果实，将果肉和种子分离，阴干，分别粉碎，过孔径 0.30 mm筛后备用。

五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素对照品，购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

所用仪器有KQ-250B型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、百灵LA114型电子天平(常熟市百灵天平仪器有限公司)和CXTH-3000高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 对照品溶液的制备 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL分别含0.04 mg五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素的对照溶液，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备 取同一批次的五味子种子粉末0.5 g，精密称定，按试验设定的液固比加入乙醇-水溶液，按设定时间超声提取后，过滤，作为供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：大连江申分离科学技术公司C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃。流动相A为甲醇，B为水溶液，梯度洗脱条件为：0～4 min，流动相A 70%，流动相B 30%；4～12 min，流动相A 70%～65%，流动相B 30%～35%；12～18 min，流动相A 65%～100%，流动相B 35%～0。流速：1.0 mL/min。检测波长：250 nm。

1.2.4 木脂素含量的测定 分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，采用外标一点法计算木脂素提取率。计算公式为：

式中：ρ为供试品质量浓度(mg/mL)，v为供试品体积(μL)，D为稀释倍数，m为供试品的质量(g)。

1.3 试验设计

1.3.1 单因素试验 根据预试验结果，以超声提取的乙醇体积分数、提取时间、液固比进行单因素试验，分别考察3个因素对木脂素提取率的影响。

(1)乙醇体积分数的影响。固定超声提取时间为10 min，液固比为40 mL/g，乙醇体积分数分别为30%，50%，70%，95%，考察其对五味子种子木脂素提取率的影响。

(2)提取时间的影响。固定乙醇体积分数为70%，液固比为40 mL/g，超声提取时间分别为10，20，30，60 min，考察其对五味子种子木脂素提取率的影响。

(3)液固比的影响。固定乙醇体积分数为70%，超声提取时间为10 min，液固比分别为10，20，40，80 mL/g，考察其对五味子种子木脂素提取率的影响。

1.3.2 中心组合设计试验 为了分析各因素及其交互作用对木脂素提取率的影响，以获得最佳的提取工艺，在单因素试验结果的基础上，以五味子木脂素提取率为考察指标，进行中心组合设计试验。中心组合设计试验的因素及水平见表1。

1.4 数据统计与分析

采用SAS 9.1软件对试验结果进行响应面分析，建立数学模型，用脊岭分析优化试验工艺，并采用ORIGIN 8.0软件进行绘图分析。

2 结果与分析

2.1 五味子种子木脂素提取的单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数的影响 由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，五味子种子木脂素提取率呈先升高后降低趋势，且于乙醇体积分数为70%时达到最高。考虑到实际生产中乙醇回收的耗能问题，应尽可能选择高体积分数乙醇进行提取，因此将乙醇体积分数考察范围定为50%～95%。

2.1.2 超声提取时间的影响 由图2可知，超声提取10 min时，五味子种子木脂素的提取率最高，随后提取率迅速下降，至20 min降为最低；超声提取20～60 min，提取率又逐渐升高。考虑到各因素间可能存在的交互作用，防止漏掉最佳提取时间点，故将超声提取时间的考察范围定为0～60 min。

图1 乙醇体积分数对五味子种子木脂素提取的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction of lignans fromSchisandraeseeds

2.1.3 液固比的影响 由图3可知，随着液固比的增加，五味子种子木脂素提取率随之提高。当液固比为10～20 mL/g时提取率增加较快；当液固比为20～40 mL/g时有所降低，此后提取率又随液固比的增加缓慢增大。为防止漏掉最佳提取的液固比条件，将液固比考察范围定为10～300 mL/g。

2.2 五味子种子木脂素提取的中心组合设计试验

采用SAS 9.1软件的RSREG(二次响应面回归模型)程序对中心组合设计试验结果(表2)进行响应面分析，经二次回归拟合，得到回归模型参数估计值见表3，方差分析结果见表4，脊岭回归分析结果见表5。

由表3可知，回归方程为：

Y=0.007 132+0.023 703x1+0.032 202x2-

0.000 003 247x1x3+0.000 005 703x2x3+

从表4可以看出，总模型的复相关系数R2=0.741 6，表明回归方程对木脂素提取率的预测值与实测值有较好的相关性。

脊岭回归分析结果(表5)表明，回归方程预测的五味子种子木脂素提取的最佳条件为：乙醇体积分数73%、超声提取时间32 min、液固比299 mL/g；在该条件下，木脂素的提取率为2.59%。验证试验发现，在上述条件下，五味子种子木脂素的平均提取率为2.47%，试验值与预测值拟合良好，进一步说明模型预测的可行性。

为了更直观地反映各因素对提取率的影响，运用ORIGIN 8.0软件绘制了响应面图，即木脂素提取率(Y)及对应的乙醇体积分数(x1)、超声提取时间(x2)、液固比(x3)构成的三维空间图形，结果见图4～6。

图4～6直观地反映了乙醇体积分数、超声提取时间及液固比3个因素两两交互作用对响应值的影响，但基于价格、能耗等因素，本研究中乙醇体积分数的最大值为95%、超声提取时间最长为60 min、液固比最高为300 mL/g，并未能全部达到极值。另由于各因素之间交互作用的影响，不能一味地将某一因素最大化而不考虑其他因素。由图4～6 可以看出，五味子种子木脂素提取的较优提取工艺范围为：乙醇体积分数为65%～95%，超声提取时间为20～40 min，液固比为100～300 mL/g，脊岭回归分析得到的结果均在此范围内，说明所得优化工艺可行。

3 结论与讨论

与其他传统提取方法，如冷浸法、回流法相比，超声提取法具有提取效率高、耗能少等优点，而且为纯物理方法，在提取过程中药材一般不发生化学变化。本研究在单因素试验基础上，通过中心组合设计-响应面分析，建立了超声辅助提取五味子种子木脂素的数学模型，回归方程的复相关系数为0.741 6，说明方程拟合良好。

通过分析得到超声提取五味子种子木脂素的最佳工艺条件为：乙醇体积分数73%，超声提取时间32 min，液固比299 mL/g。在此条件下，经多次验证，五味子种子木脂素提取率为2.47%，与理论值(2.59%)十分接近，说明所建立的预测模型可行，这为从五味子种子中大规模提取木脂素提供了可能。

[1] 田 洋.五味子有效成分提取工艺研究进展 [J].农业科技与装备,2011(5):29-30.

Tian Y.Research on extraction process of effective components inSchisandrachinenesis[J].Agricultural Science & Technology and Equipment,2011(5):29-30.(in Chinese)

[2] Panossian A,Wikman G.Pharmacology ofSchisandrachinensisBail.:An overview of Russian research and uses in medicine [J].Journal of Ethnopharmacology，2008,118(2)：183-212．

[3] 史 琳,王志成,冯叙桥.五味子化学成分及药理作用的研究进展 [J].药物评价研究,2011,34(3):208-212.

Shi L,Wang Z C,Feng X Q.Advances in studies on chemical constituents and pharmacological activities ofSchisandraechinensis[J].Drug Evaluation Research,2011,34(3):208-212.(in Chinese)

[4] 陈业高,秦国伟,谢毓元.五味子科植物的木脂素成分 [J].武汉植物学研究,2001,19(2):158-168.

Chen Y G,Qin G W,Xie Y Y.Lignans from plants ofSchisandraceae[J].Journal of Wuhan Botanical Research,2001,19(2):158-168.(in Chinese)

[5] 丁 佐,鲁巍巍,李宏博,等．HPLC 同时测定北五味子中5 种木脂素的含量 [J].中国中药杂志，2010，35(13):1728-1730．

Ding Z,Lu W W,Li H B,et al.Simultaneous determination of five kinds of lignans inSchisandrachinensis(Turcz.) Baill in HPLC [J].China Journal of Chinese Materia Medica,2010，35 (13):1728-1730．(in Chinese)

[6] 栗 爽,王 冰.HPLC法测定不同产地五味子种子中3种木脂素类含量 [J].江西中医药,2009,40(1):58-59.

Li S,Wang B.Determination of three kinds of lignans inSchisandrachinensisfrom different habitats by HPLC [J].Jiangxi Journal of Traditional Chinese Medicine,2009,40(1):58-59.(in Chinese)

[7] 胡俊扬,陆兔林,毛春芹,等.HPLC法同时测定不同产地五味子中8种木脂素类成分 [J].中成药,2012,34(2):313-316.

Hu J Y,Lu T L,Mao C Q,et al.Simultaneous determination of eight lignans inSchisandrachinensisfrom different habitats by HPLC [J].Chinese Traditional Patent Medicine,2012,34(2):313-316.(in Chinese)

[8] 黄文倩,李 丽,肖永庆,等.HPLC同时测定五味子中6种木脂素类成分 [J].中国实验方剂学杂志,2011,17(10):63-66.

Huang W Q,Li L,Xiao Y Q,et al.Simultaneous determination of six lignans inSchisandrachinensisby HPLC [J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2011,17(10):63-66.(in Chinese)

[9] 王 蒙,刘红耀,闫 明,等.五味子乙素逆转膀胱肿瘤多药耐药的实验研究 [J].中国医疗前沿,2010,23(5):28-29.

Wang M,Liu H Y,Yan M,et al.Reversal effect of SchB on bladder tumor multidrug resisitance [J].National Medical Frontiers of China,2010,23(5):28-29.(in Chinese)

[10] 李月珍,刘志新,赵富生,等.不同浓度五味子乙素对人胃癌细胞株MGC-803 增殖、凋亡的影响 [J].牡丹江医学院学报,2010,31(4):1-5.

Li Y Z,Liu Z X,Zhao F S,et al.Effects of the different concentrationSchisandrinB inducing multiplication and apoptosis on human gastric cancer cell line MGC-803 [J].Journal of Mudanjiang Medical University,2010,31(4):1-5.(in Chinese)

[11] 李 玲,胡 汛,潘锵荣,等.五味子乙素对 MRP 介导的肿瘤多药耐药逆转作用的研究 [J].同济大学学报:医学版,2006,27(6):19-23.

Li L,Hu X,Pan Q R,et al.Study ofSchisandrinB on multidrug resistance reversal effect of MRP mediated tumor multidrug [J].Journal of Tongji University:Medical Science Edition,2006,27(6):19-23.(in Chinese)

[12] 可成友,边 蔷,康宏玲,等.北五味子中4种木脂素类化合物的高效液相色谱法同时测定 [J].时珍国医国药,2010,21(10):2523-2525.

Ke C Y,Bian Q,Kang H L,et al.Simultaneous determination of four lignans inSchisandrachinensis(Turcz.) Baill by HPLC [J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2010,21(10):2523-2525.(in Chinese)

[13] 张利康,陈海霞,焦 健.北五味子果实中化学成分的研究 [J].天然产物研究与开发,2012(24):5-7.

Zhang L K,Chen H X,Jiao J.Chemical study on the fruit ofSchisandrachinesis(Turcz.) Baill [J].Natural Product Research and Development,2012(24):5-7.(in Chinese)

[14] 杨 磊,马春慧,祖元刚.北五味子木脂素超声提取工艺 [J].农业工程学报,2009,25(1):185-192.

Yang L,Ma C H,Zu Y G.Technology for extracting lignans fromSchisandrachinesnsis(Turcz.) Baill by ultrasonic extraction [J].Transactions of the CSAE,2009,25(1):185-192.(in Chinese)

[15] 曹丽萍.五味子木脂素提取方法研究 [J].辽宁中医药大学学报,2011,13(1):185-187.

Cao L P.Advances on the extraction technologies of efficient components inSchisandrachinensis(Turcz.) Baill [J].Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,2011,13(1):185-187.(in Chinese)

[16] 程 敏,王 璐,宋小妹.HPLC法测定五味子品种中木脂素含量 [J].西北大学学报,2011,41(3):459-462.

Cheng M,Wang L,Song X M.Determination of lignan content inSchisandrachinensisby HPLC [J].Journal of Northwest University,2011,41(3):459-462.(in Chinese)

Optimization of lignans extraction technique fromSchisandrachinensisby supersonic wave

ZHANG Yue-yi,ZHAO Yan,LIU Yong-hui,WEN Xin,CHENG Ming,SHENG Yan-ling,YANG He,LIU Shuang-li,ZHANG Lian-xue

(CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study investigated the effects of ethanol concentration,ultrasonic extraction time,liquid to solid ratio and their interaction on extraction rate of lignans fromSchisandrachinensisand optimized the extraction technique.【Method】 Using lignans extraction rate as examining index,ethanol concentration,ultrasonic extraction time and solid to liquid ratio as factors,single factor experiment was carried out.Then,central composite design experiment was carried out based on the determined factors and levels.SAS 9.1 and response surface analysis were used to establish the regression model and the optimal ultrasonic extraction conditions were achieved.【Result】 The optimal conditions were:ethanol concentration 73%,ultrasonic extraction time 32 min,and liquid to solid ratio 299 mL/g.The extraction yield of lignans was 2.47%,which was close to the theoretical value of 2.59%. 【Conclusion】 The optimization extraction conditions for lignans from schisandrae seeds were obtained.

Schisandrachinensis;lignan;extraction technique;central composite design;response surface analysis

2013-12-11

国家科技支撑计划项目(2011BAI03B01)；国家公益性行业科研专项(201303111)；吉林省科技发展计划项目(20126046)；吉林省产业技术体系项目(201218)；吉林省中医药产业发展专项(YYZX201258)

张悦怡(1990-)，女，吉林长春人，硕士，主要从事天然药物化学成分与生物活性研究。 E-mail：cherishleforever@163.com

赵 岩(1979-)，男，吉林长春人，副教授，博士，主要从事天然药物化学成分与生物活性研究。 E-mail：zhyjlu79@163.com

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.033

R284.2

A

1671-9387(2015)06-0215-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.033.html