陕西7个毛樱桃自然居群遗传多样性的SSR评价

何恒流,蔡宇良,高天翔,李 彬,宛 甜,王 玉

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100)

陕西7个毛樱桃自然居群遗传多样性的SSR评价

何恒流,蔡宇良,高天翔,李 彬,宛 甜,王 玉

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 研究陕西野生毛樱桃自然居群的遗传多样性，为科学保存和利用陕西野生毛樱桃资源提供理论依据。【方法】 以陕西野生毛樱桃的7个自然居群140份样本为材料，用SSR分子标记技术研究其遗传多样性和遗传结构。【结果】 用10对SSR引物从7个毛樱桃自然居群中共检测出92个等位基因，各引物扩增的条带在6～14个。居群多态位点比率(PPL)为100%,Shannon’s 信息指数(I)平均值为1.280，Nei’s 基因多样性指数(H)平均值为0.655，可观察杂合度(Ho)平均值为0.584，期望杂合度(He)平均值为0.672，表明陕西7个毛樱桃自然居群具有较高的遗传多样性水平。居群的基因分化系数Fst=0.181，表明陕西野生毛樱桃的遗传变异主要存在于居群(81.9%)内，遗传分化居群内高于居群间，基于Fst测得基因流Nm为1.128。利用UPGMA对7个毛樱桃自然野生居群进行聚类，可以分为3类：麟游(LY)、绣房(XF)、华阴(HY)、哭泉(KQ)归为第1类，小峪(XY)为第2类，鹦鸽(YG)和青化(QH)归为第3类。【结论】 李属植物SSR引物在毛樱桃上能够有效的转移利用，陕西毛樱桃自然居群具有较高的遗传多样性水平，其中华阴居群遗传多样性水平最高，遗传分化居群内高于居群间，7个居群可聚为3大类。

野生毛樱桃；SSR；遗传多样性；遗传结构

根据中国植物志分类，毛樱桃(Prunustomentosa,2n=16)隶属蔷薇科李属樱亚属[1]，原产于中国，以野生为主，具有极强的抗寒性及较强的抗旱、抗瘠薄能力，毛樱桃在园艺生产上已经得到广泛运用。野生毛樱桃在陕西山区广泛分布，但果实风味差异很大，有些还十分鲜美[2]。由于人为等因素的影响，一些山区的野生毛樱桃资源濒临灭绝。通过分子生物学技术研究陕西野生毛樱桃种质资源遗传多样性水平及居群遗传结构，对科学有效制定野生毛樱桃资源保护策略、收集野生优良毛樱桃种质资源、丰富和改良现有栽培品种都具有重要意义。

过去对于毛樱桃的研究集中于形态、生理学等领域[3-4]，也有利用SSR分子标记技术对部分地区毛樱桃群体进行研究的报道[5]。SSR分子标记技术具有多态信息含量高、重复性好和呈共显性的特点，已被广泛用于樱亚属植物居群的遗传分析[6-8]。张琪静[9]就北方5个省收集的44份毛樱桃进行SSR分析，验证了种与种之间引物的转移利用，与近缘种聚类分析时，毛樱桃独自聚为一组。宛甜等[5]就秦岭部分毛樱桃居群做SSR分析，发现秦岭毛樱桃遗传多样性较为丰富。陕西野生毛樱桃种质资源丰富，对其居群比较全面的研究尚未见报道。为此，本试验利用SSR分子标记技术对陕西野生毛樱桃7个居群140份毛樱桃材料进行了遗传多样性和居群遗传结构分析，以期充分了解陕西野生毛樱桃居群的种质资源信息，为中国野生毛樱桃资源的有效保存和合理利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2013年5-7月，根据国内有关植物标本馆(室)记载，以及走访地方有关研究人员了解相关资料后，在陕西省选取7个具有代表性的地点对野生毛樱桃资源的生存现状进行了野外调查，根据自然居群现有分布规模对每个居群以“株”为单位随机取样，样本间距离大于50 m，采集幼叶立即放入装有干燥硅胶的自封塑料袋中干燥、备用。采集样本共140份归属7个居群，详见表1。

1.2 DNA提取和SSR-PCR

样本DNA提取采用改进的3×CTAB 提取法[10]，利用紫外分光光度计和1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和品质，稀释至40 ng/μL,保存于-20 ℃备用。

SSR-PCR反应体系共10 μL,包含0.2 mmol/L引物0.6 μL，30～60 ng DNA 模板，5 μL PCR MIX混合液(康维公司)。其反应程序为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，58～54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，8 ℃保存。

本试验所选择的120对SSR引物选自在李属的樱桃、桃、李和杏上已见报道[11-18]的引物，根据居群规模从7个居群中随机取样 20 份用于引物筛选，通过SSR-PCR扩增，最终选出了条带清晰、重复性好、稳定性高的10对引物(表2)，以对140份毛樱桃材料进行进一步分析。将所有材料的扩增产物(2 μL)在1×TBE缓冲液中于恒定功率(50 W)下，用12%聚丙烯酰胺凝胶分离2 h，终止电泳，银染显色，照相保存。

1.3 数据分析

根据扩增片段分子量大小对扩增结果进行条带分析，所得扩增片段纯合子记为“AA或BB”，杂合子记为“AB”[19]。所得数据用POPGENE32软件进行分析，获得可用于评价居群遗传多样性的指标，包括多态位点比率(PPL)、可观察等位基因数(A)、有效等位基因数(Ae)、Shannon’s 信息指数(I)、Nei’s基因多样性指数(H)、可观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)；以及反映居群遗传结构的指标，包括莱特固定指数(Fis)、种群间基因分化系数(Fst)、基因流(Nm)、遗传相似度(GI)、Nei’s遗传距离(GD)等。根据遗传相似度和Nei’s遗传距离，采用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析，并且在Nei’s遗传距离的基础上绘制居群聚类图。

2 结果与分析

2.1 SSR引物对陕西7个毛樱桃居群的扩增结果

从120对引物中共筛选出10对条带清晰、重复性好的引物，各引物扩增所得可观察等位基因数为6～14(表2)，均有丰富扩增。引物筛选结果显示，来自桃的引物转移率最高，达35%，来自李的引物转移率最低，为15%。图1为引物Pchcms4在华阴居群上的扩增电泳结果。

图1 引物Pchcms4对华阴毛樱桃居群的扩增产物
M.DNA 标准分子量;1～20.华阴居群(HY)1～20号单株
Fig.1 Amplified products of Huayin population ofPrunustomentosausing primer Pchcms4
M.50 bp DNA Marker;1-20.The samples of Huayin population(HY)

2.2 陕西7个毛樱桃居群的遗传多样性

由表3可知，10对引物在陕西7个毛樱桃居群间扩增丰富，各居群多态位点比率为100%。在居群水平上，可观察等位基因数(A)、有效等位基因数(Ae)、Shannon’s信息指数(I)、Nei’s基因多样性指数(H)均值分别为4.929，3.340，1.280和0.655。Nei’s基因多样性指数(H)是衡量居群遗传多样性最常用的指标,据此可知陕西7个毛樱桃居群遗传多样性水平从大到小依次为HY>KQ>XY>XF>QH>YG>LY。

2.3 陕西7个毛樱桃居群的遗传结构

由表4可知，陕西7个毛樱桃自然居群的种群间基因分化系数(Fst)为0.104～0.236，居群间的平均基因分化系数为0.181，这说明毛樱桃居群81.9%的遗传分化存在于居群内，18.1%的遗传分化存在于居群间，表明陕西野生毛樱桃遗传变异主要存在于居群内。基于Fst测得基因流(Nm)为1.128。由莱特固定指数(Fis)可知，除UDP96-008、UDP98-025、UCD-CH31为负值外，其他引物均为正值，说明缺乏或存在过多的纯合子。除UDP96-008、UDP97-403、UDP98-025位点外，居群在其他位点均偏离 Hardy-Weinberg 平衡(P< 0.05)，其表现为可观察杂合度明显低于期望杂合度。

2.4 陕西7个毛樱桃居群的聚类结果

基于陕西7个毛樱桃居群间的遗传距离(表5)，采用 UPGMA 法进行聚类分析，进一步直观分析居群间的遗传关系，结果如图2所示。由图2可知，在遗传距离为0.6(图中虚线所示位置)时，陕西7个毛樱桃居群可归为3大类：其中麟游(LY)、绣房(XF)、华阴(HY)与哭泉(KQ)居群归为一类，小峪(XY)居群归为第2类，鹦鸽(YG)和青化(QH)居群归为第3类。由图2还可看出，麟游(LY)与绣房(XF)居群的亲缘关系最近，与青化(QH)居群的亲缘关系最远。

注：表中右上为遗传相似度，左下为遗传距离。

Note:Above diagonal is genetic identity while below diagonal is genetic distance.

3 讨 论

3.1 SSR引物的扩增

本试验从120对李属植物引物中筛选出10对扩增条带清晰、稳定的引物，其中来自桃的引物表现出较高的转移率，达35%，而李的引物在毛樱桃中表现出较低的转移率，仅为15%，此研究结果与张琪静[9]的研究结果相似。引物UDP96-001、UCD-CH31在陕西7个毛樱桃居群上扩增的可观察等位基因数均高于其在土耳其野生甜樱桃上的扩增数(12∶6，9∶4)[20]。同样是在毛樱桃上，本研究中引物UDP96-001、UCD-CH31扩增的可观察等位基因数也比Zhang等[10]的研究结果略高(12∶5，9∶4)。黄磊等[21]认为，引物扩增情况与研究对象有关，并在一定范围内随居群个体数增多，引物扩增的可观察等位基因数增加。

3.2 陕西毛樱桃居群的遗传多样性

本研究比较全面地对陕西野生毛樱桃居群进行了遗传多样性分析。其Shannon’s 信息指数(I)平均为1.280，Nei’s 基因多样性指数(H)平均为0.655，与近缘物种相比，高于同属于李属的杏[22]、马哈利[23]以及同是蔷薇科的新疆野苹果[24]，表明陕西野生毛樱桃居群的遗传多样性水平较高。秦伟等[25]认为，新疆野生苹果通过种子实生繁殖等一套固有的繁殖体系来维持种群的繁殖，从而保持了其较高的遗传多样性水平。毛樱桃自花结实能力很强，以实生繁殖为主，供试7个居群材料丰富、分布广泛，而且有些居群就位于秦岭巴山的多样性中心，这可能是导致陕西野生毛樱桃居群遗传多样性水平较高的主要原因。

3.3 陕西毛樱桃居群的遗传结构

居群遗传结构是遗传变异在时间、空间上的分布式样，是突变、基因流、选择和遗传漂变共同作用的结果，用来揭示居群内部的分布格局。遗传分化是反映遗传结构的重要指标。本研究中7个毛樱桃居群的基因分化系数Fst=0.181，表明陕西野生毛樱桃的遗传变异主要存在于居群内(81.9%)，遗传分化居群内高于居群间。在对与毛樱桃相近物种的相关研究中也有一致的结果[5，9]。基因流是影响居群遗传分化的重要因素，Loveless等[26]认为，当居群间基因流大于1时，基因流起到均质化作用。本研究中7个毛樱桃居群的基因流Nm=1.128>1，表明基因流可能是引起毛樱桃居群间遗传分化的重要因素。对于野生毛樱桃居群而言，由于各居群地理位置距离较远，导致居群的开花期不同，以及山脉的阻隔，都影响了毛樱桃居群间的基因交流。蔡宇良[27]认为，种子散布机制对居群间的遗传分化有显著影响，中国樱桃主要依靠动物消化系统传播种子，其种子流受到动物活动范围的制约。据此推测，在陕西山区复杂的地理环境下，以野生毛樱桃果实为生的鸟兽可能是影响毛樱桃居群遗传结构的重要因素。

野生毛樱桃资源在陕西山区虽然分布广泛，但此次野外实地考察发现，此类野生资源遭受人为破坏的现象严重，部分地区的野生毛樱桃资源濒临灭绝，因此有必要加强野生毛樱桃资源的保护。本研究中7个居群的遗传变异主要存在于居群内，而居群间遗传分化系数较大，所以在重点保护遗传多样性丰富的野生居群时应兼顾不同地理区域居群。在7个自然居群中，华阴(HY)居群遗传多样性水平最高，因此，在利用和保护陕西野生毛樱桃种质资源时，可以优先考虑华阴(HY)居群。

4 结 论

利用10对SSR引物对陕西7个野生毛樱桃自然居群的遗传多样性进行了分析，结果表明，李属植物SSR引物在毛樱桃上能够有效的转移利用，7个毛樱桃自然居群的遗传多样性水平丰富，其中华阴居群遗传多样性最高，居群内遗传分化高于居群间。通过聚类分析，可将7个居群聚为3类。

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SSR evaluation of genetic diversity of seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi

HE Heng-liu,CAI Yu-liang,GAO Tian-xiang,LI Bin,WAN Tian,WANG Yu

(CollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study investigated the genetic diversity of wildPrunustomentosapopulations to provide theoretic reference for utilization and conservation of thus resources in Shaanxi.【Method】 A total of 140 samples from seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi were collected to study genetic diversity and genetic structure using SSR markers.【Result】 A total of 92 alleles of 10 loci were detected from seven wildPrunustomentosapopulations and the number of alleles per locus ranged from 6 to 14.The percentage of polymorphic loci (PPL) was 100% in populations.The mean Shannon’s information index (I),Nei’s gene diversity (H),observed heterozygosity (Ho),and expected heterozygosity (He)were 1.280,0.655,0.584 and 0.672,respectively.The results revealed that the genetic diversity in the wildPrunustomentosaof the 7 populations in Shaanxi was rich. About 81.9% of (Fst=0.181) gene differentiation was observed within the populations,higher than among populations.According to gene differentiation coefficient,the gene flow (Nm) was 1.128.Based on un-weighted pair-group method, the seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi were divided into three groups:group one included LY,XF,HY,and KQ,group two included XY,and group three contained YG and QH.【Conclusion】 Genetic diversity in the wildPrunustomentosain Shaanxi was rich,and that of HY population was the richest.The genetic differentiation within each population was higher than among populations.And the 7 populations were divided into 3 groups.

Prunustomentosa;SSR;genetic diversity;genetic structure

2014-07-11

“十二五”国家科技计划项目(2013BAD02B00)；唐仲英果树育种基金项目(2009YZ033)

何恒流(1989-)，男，安徽合肥人，在读硕士，主要从事樱桃育种与种质资源研究。E-mail:526610925@qq.com

蔡宇良(1964-)，男，陕西宝鸡人，教授，主要从事果树育种与栽培研究。E-mail:cylxlcz0673@sina.com

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.021

S662.501

A

1671-9387(2015)06-0193-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.021.html