玉米诱变与原自交系株高变化的蛋白质组学及差异基因的功能分析

吕二锁，逯晓萍，王树彦，薛春雷，韩平安，董 婧，任 锐，李美娜

(1 内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特010019；2 呼和浩特市合创农业科技研究中心，内蒙古 呼和浩特011500；3 呼和浩特市种子管理站，内蒙古 呼和浩特 010020)

玉米诱变与原自交系株高变化的蛋白质组学及差异基因的功能分析

吕二锁1，逯晓萍1，王树彦1，薛春雷2，韩平安1，董 婧1，任 锐2，李美娜3

(1 内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特010019；2 呼和浩特市合创农业科技研究中心，内蒙古 呼和浩特011500；3 呼和浩特市种子管理站，内蒙古 呼和浩特 010020)

【目的】 研究玉米经EMS处理后诱变系与原自交系的蛋白表达机制，为从蛋白质组学角度揭示诱变后选育材料在株高发生变化及生物产量明显提高等方面的分子理论奠定基础。【方法】 以玉米(ZeamaysL.)优良自交系AMD16和诱变后选育材料为试材，采用双向电泳、质谱分析以及检索技术，比较选育材料与原自交系叶片蛋白质组的差异，并对其候选基因进行分离、克隆，构建植物表达载体p3300-ZmMDH6，最后进行拟南芥的遗传转化与鉴定。【结果】 EMS诱变后选育材料的蛋白质组中出现21个差异蛋白质点，其中5个蛋白质点在选育材料中特异表达，1个蛋白质点下调表达，7个蛋白质点上调表达，有2个差异蛋白质点在原自交系中表达，而未在选育材料中表达。通过 MALDI-TOF-MS 质谱测序和 MASCOT 序列分析，鉴定出了15个差异表达蛋白质点，其功能涉及生物细胞代谢/能量代谢、防御/抗胁迫、细胞蛋白合成和叶绿素合成等细胞过程。用RT-PCR方法克隆了其候选基因ZmMDH6的编码区cDNA，长度1 296 bp，由432个氨基酸残基组成，分子质量46.80 ku，等电点5.79；并构建植物表达载体进而转化拟南芥，经检测证明已获得T1代转基因植株。【结论】 玉米诱变系与原自交系在蛋白丰度上存在明显的差异；差异表达蛋白涉及到各个生长发育过程，可能与玉米生物产量的提高和株高的改变有密切关系。

玉米；蛋白质组；苹果酸脱氢酶；基因克隆；基因表达

玉米(ZeamaysL.)已成为当今世界上重要的粮食与经济作物，在农业生产中具有重要的地位[1]。优良的玉米自交系是利用玉米杂种优势和发展玉米产业的基本材料，也是玉米育种的物质载体[2-3]。伴随农业生产水平的逐渐提高和新品种的不断推广应用，对玉米优良育种材料的要求也越来越高；但在玉米选育过程中，多数优良玉米种质资源利用频率高，品种间相近的亲缘关系使得优良基因的利用潜力受到极大限制，因而遗传基础狭窄、缺乏持续选择的有利基因已成为提高玉米产量、改善品质及增强抗性的主要瓶颈，创造出具有丰富遗传基础的玉米种质资源是目前玉米育种工作者迫切需要解决的首要问题[4]。选用化学诱变育种EMS-石蜡油诱变玉米成熟花粉技术现已成为玉米种质创新和自交系改良的有效方法。但是，对诱变后代材料的选育及研究工作主要集中于植株农艺性状及突变基因定位等方面[5-7]，而从蛋白质组学角度去揭示株型、产量性状诱变后变化的相关报道较少。

目前功能基因组学已成为后基因组时代的研究重心，蛋白质组学则是其研究热点，而玉米作为重要的粮食、经济和能源作物，关于玉米的蛋白质组学研究发展也在不断进行中，并涉及到遗传、生理生化以及胁迫相关蛋白质组学研究。Von Wiren等[8]利用双向电泳技术对玉米野生型与突变型材料的蛋白质组学的研究表明，2种不同类型玉米在铁离子跨膜蛋白中有4个蛋白质点存在差异； Damerval等[9]通过对玉米不同近等基因自交系的2D-PAGE图谱进行分析，从酶学的角度证明了Opaque 2是因为玉米转录因子的点突变从而引起的蛋白质效应，Opaque 2在谷类作物不同代谢过程中具有调节作用；Chang等[10]应用2D-PAGE图谱与质谱测序方法，研究了35S-Met的摄入量对玉米缺氧胁迫条件下根内蛋白质合成的影响评价，结果表明蛋白质表达的选择性可能对玉米生长发育和细胞功能造成一定影响；Okamoto等[11]对玉米卵母细胞中的主要蛋白质组进行研究、鉴定，确定了6个已知功能的蛋白质点，并认为在玉米代谢过程中几种蛋白酶的表达水平在卵母细胞较高。采用蛋白质双向电泳和MALDI-TOF技术，Hochholdinger Frank等[12]对玉米侧根生长的缺陷突变体与正常野生型根进行蛋白质组分析比较，发现差异表达的蛋白质点中有4个蛋白质点与木质素的代谢相关。

苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenasa,MDH)是一种普遍存在于自然界各种生物体中的酶类，在动植物细胞中有着重要的生理功能，能够催化苹果酸和草酰乙酸的相互转化，并使其植物体内的苹果酸含量增加，进而使植物体对耐酸及铝毒等非生物胁迫的抗性提高[13-14]。相关研究表明，苹果酸脱氢酶在促进植物细胞发育、植株生长、花粉发育和果实发育过程及抗逆性等方面起着重要的作用[15-16]，表明苹果酸脱氢酶对植物的生长发育起到重要作用。

本研究以自交系AMD16经EMS-石蜡油诱变后选育的材料及原自交系为试材，采用改进后的三氯乙酸-丙酮(TCA)法提取总蛋白质，运用双向电泳、质谱分析确定玉米诱变体与原自交系存在差异的候选基因，并对其候选基因苹果酸脱氢酶(MDH)基因进行分离、克隆，构建了植物表达载体p3300-ZmMDH6，进行拟南芥的遗传转化与鉴定，为进一步研究该基因在玉米抗逆及增产中的作用奠定基础，同时为玉米种质资源的创制以及诱变育种提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选取18份优良玉米自交系为原始诱变材料，于2011年4月下旬在呼和浩特市合创农业科技研究中心园区进行种植，并于当年7月中旬开花期利用EMS-石蜡油对玉米成熟花粉进行诱变处理，每个自交系采用5种不同浓度的EMS-石蜡油处理，每个浓度下选取6株，共处理540株，10月对诱变材料进行收获(EMS-石蜡油处理浓度为0.667×10-3时诱变率最高可达到4.30%)。11月将收获的M1代诱变材料在海南省农业科学院实验田进行加代繁殖。2012年同样进行呼和浩特种植、南繁加代，同时对诱变后代材料连续进行考查。在对自交系AMD16诱变选育材料与原始材料的考查中发现其株型(株高、穗位高、叶长、叶宽及雄穗分枝数)、生物产量等指标发生较大变化，详见表1。因此，2013年选取株高、生物产量明显提高的AMD16诱变第4代材料与原自交系AMD16为试材。野生型拟南芥(Ecotype Columbia)为内蒙古农业大学农学院玉米遗传育种实验室原有保存材料。

1.2 酶与试剂

聚丙烯酰胺凝胶组分为DTT、碘乙酰胺、硫脲、Tris、CHAPS、甘氨酸，均为 Amersham Biosciences公司产品；尿素、考马斯亮蓝、两性电解质载体、固相线性 pH 梯度 IPG 胶条(17 cm,pH 4～7)，均购于美国 Bio-Rad 公司；蛋白定量试剂盒购自上海生物工程有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自TaRaKa公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根公司；超表达载体pCAMBIA 3300 (p3300)由内蒙古农业大学农学院玉米遗传育种实验室保存，北京华大基因公司进行PCR引物的合成与测序任务。

1.3 玉米叶片总蛋白提取及浓度测定

1.3.1 玉米叶片总蛋白提取 将玉米幼苗培养至3叶期，取3叶期玉米叶片，用超纯水清洗、无菌滤纸擦干，然后去掉叶片主脉将其剪成约1 cm左右的小段，液氮速冻保存于-80 ℃备用。称取0.3 g速冻玉米叶片，加入0.03 g聚乙烯吡咯烷酮，立即在液氮冷冻条件下研磨至精细粉末状。吸取4.5 mL的预冷蛋白质提取液Ⅰ(含0.07% β-巯基乙醇的10% 三氯乙酸丙酮溶液) 加入经研磨的粉末中，后冰浴研磨2 min，快速转入已预冷的5 mL离心管中，涡旋混合后于-20 ℃冰箱冷冻放置1 h后，4 ℃下12 000 r/min离心45 min，弃上清液。再吸取 4.5 mL预冷的蛋白提取液Ⅱ(含 0.07% β-巯基乙醇的丙酮)加入离心管，充分混合，悬浮、振荡，使其蛋白质充分溶解，于-20 ℃冰箱冷冻放置1 h后离心弃上清液。此步骤重复操作 2 次。再加4.5 mL 预冷的80%丙酮，然后进行悬浮、振荡，离心后弃上清液，将沉淀风干。干燥后称重减掉试管质量得蛋白质干粉质量。每毫克蛋白质干粉加入0.02～0.03 mL裂解液(9.0 mol/L 尿素、0.2% pH 3～10 两性电解质载体、5% β-巯基乙醇、4% 两性电解质NP40)，对其蛋白质溶液进行悬浮、振荡3 min，并于35 ℃保温30 min 以上，12 000 r/min离心 45 min，取上清液适量分装，快速放入-80 ℃冷冻备用。

1.3.2 总蛋白浓度的测定 蛋白质样品的浓度测定参考1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法(Bradford法)。

1.4 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色

等电聚焦参照 Bio-Rad 公司的双向凝胶电泳系统使用说明书进行操作，采用固相线性pH梯度IPG胶条(17 cm，pH 4～7)和 IPGphorⅡ系统。吸取0.8 g的蛋白质提取液到IPG等电聚焦槽，仪器运行条件设置为 20 ℃、50 V主动水化16 h，250 V线性除盐 30 min，500 V快速除盐30 min，4 000 V线性升压 3 h，20 000 V/h 快速聚焦和500 V 72 h保持；聚焦完成后，迅速把含蛋白样品的IPG 胶条放入平衡液Ⅰ(6 mol/L Urea，2.0%SDS，20.0%甘油，0.375 mol/L This-HCl (pH 8.8)， 2.0%DTT)及平衡液Ⅱ(6 mol/L Urea，2.0%SDS，20.0%甘油，0.375 mol/L This-HCl (pH 8.8)，2.5%碘乙酰胺)先后各平衡12～15 min，然后将平衡好的胶条立即转移至 12% SDS-PAGE 均匀分离胶(厚度为1 mm)上端，并使两胶面紧密接触，排净气泡后用 1%低熔点琼脂糖进行封胶。最后将板胶置于 Ettan Dalt six(GE Healthcare，USA)系统中进行第二向变性胶恒温(25 ℃)电泳，电泳功率参数设置为 120 V/胶 0.5 h，180 V/胶 6 h。

双向电泳结束后，先将电泳胶板放入固定液中固定30 min，然后采用考马斯亮蓝染色法，将凝胶在染色液中慢速摇动染色4 h以上，不可超过12 h，染色后转移至脱色液中摇动脱色，其间可以更换脱色液1～2次，直至胶板背景清晰、无色。

1.5 玉米叶片总蛋白双向电泳凝胶图谱分析

考马斯亮蓝染色后的凝胶经UMAX Powerlook 2100XL透射扫描获取清晰电泳凝胶图像，光学分辨率一般为600 dpi，其对比度与亮度均采用软件默认值。扫描后获得的凝胶图像用PDQUEST 8.0软件进行背景消减、斑点检测、匹配及获取斑点位置坐标等分析比对。

1.6 差异蛋白质点的质谱鉴定与匹配搜索

本试验对21个差异表达蛋白质点进行脱色和胶上原位消化、酶解操作；将其酶解后的肽混合物送往中国农业科学院蜜蜂研究所，对其进行MALDI-TOF-MS测序分析，其中 15个蛋白质点获得肽质量指纹图，运用软件 MASCOT (http://www.matrixscience.com/)选择 NCBI 数据库进行 PMF分析获得鉴定结果。

1.7 基因克隆与测序

根据本研究中差异蛋白质点质谱测序获得的ZmMDH6(登录号Accession No.gi|162462- 055)基因，从GenBank数据库中获取其全长cDNA序列，在其编码区设计正向引物5′-GCTCTAGAGCCCAAAGCCACTCCCAAAC-3′(下划线为正向引物BamHⅠ位点)和反向引物5′-CGGGATCCCGGTCGAAATCACAGGCAAA-3′(下划线为反向引物XbaⅠ位点)；提取AMD16诱变后选育材料幼苗期叶片的总RNA，并以其反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系总体积为25 μL，包括10 mmol/L dNTP mix 2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 0.25 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.25 μL，ddH2O 18 μL。反应程序为:94 ℃ 3 min； 94 ℃40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，32个循环；72 ℃ 10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、回收，将回收后的目的片段与克隆载体 pMD19-T(TaKaRa)进行连接，随后进行大肠杆菌DH5α的转化，将PCR鉴定为阳性克隆的菌液送往北京华大基因公司测序。

1.8 植物表达载体的构建与农杆菌转化

分别选用BamHⅠ和XbaⅠ将已构建好的克隆载体pMD19-T-ZmMDH6和超表达载体pCAMBIA 3300(p3300)空质粒进行双酶切，回收目的基因小片段与载体基因大片段，将二者用T4 DNA连接酶连接，然后进行大肠杆菌DH5α感受态细胞的遗传转化。挑取颜色、形态均正常的单菌落摇菌，用ZmMDH6基因特异性引物进行菌液PCR的扩增与鉴定(方法同1.7节)，阳性克隆菌液用质粒小提试剂盒(天根公司)提取质粒DNA，随后用BamHⅠ和XbaⅠ内切酶再进行酶切鉴定。预先制备GV3101根癌农杆菌感受态细胞：取1 μL构建好的表达载体p3300-ZmMDH6质粒用冻融法转化根癌农杆菌GV3101，挑取平板上颜色、形态正常的单菌落摇菌，用ZmMDH6基因特异性引物进行菌液PCR鉴定(方法同1.7节)，阳性克隆保存于-76 ℃，同时选择阳性克隆用于拟南芥转化。

1.9 玉米半定量RT-PCR分析

将玉米β-Actin基因作为内参基因进行 RT-PCR 反应，每个反应设2次重复。将玉米供试材料的cDNA 稀释10 倍后作为模板，引物设计在基因的 3′非编码区，β-Actin的上下游引物分别为5′-AAATGACGCAGATTATGTTTGA-3′和5′-GCTCGTAGTGAGGGAGTACC-3′。PCR反应体系为10×Buffer 1.5 μL，dNTP 1.2 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.15 μL，正、反向引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 10.15 μL，终体积15 μL。扩增程序为94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，25个循环；最后72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.10 拟南芥的转化与鉴定

将野生型拟南芥(Ecotype Columbia)种子在实验室培养20 d左右，按照沾花法将预先配制好的农杆菌菌液转化野生型拟南芥。混合收获转化植株种子得到T1代遗传转化种子，将T1代种子播种，于出苗后20 d用0.5‰的除草剂PPT(phosphinothricin)喷雾并筛选其阳性拟南芥植株，大约在1周后非转化植株枯黄、死亡，而获得转化的拟南芥则生长正常。提取经PPT喷雾筛选后生长正常的拟南芥植株基因组DNA，然后用ZmMDH6基因特异性引物通过PCR(方法同1.7节)鉴定拟南芥阳性植株。同时，为了避免扩增出拟南芥内源MDH基因序列，确保拟南芥转基因株系鉴定的真实可靠，选用载体上的筛选标记基因bar进行扩增鉴定，以质粒为正对照,非转基因拟南芥为负对照。用于扩增标记基因的正向引物为5′-CCAGAAACCCACGTCATGCC-3′，反向引物为5′-CAGGAACCGCAGGAGTGGA-3′，基因扩增产物长度为370 bp。扩增程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s,循环32次；72 ℃延伸8 min。PCR反应体系为10×Buffer 2.5 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.2 μL，dNTP 2.0 μL，正、反向引物(10 μmol/L) 各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 17.3 μL，终体积25 μL。产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测、鉴定。

2 结果与分析

2.1 玉米幼苗叶片双向电泳图像分析

本研究采用三氯乙酸-丙酮法分别提取玉米优良自交系AMD16原始材料及其诱变系选育材料的幼苗3叶期叶片总蛋白质，经蛋白浓度定量后进行双向电泳分析，得到了重复性与分辨率都较好的 2-D 图像(图1)。对电泳图谱采用PDQUEST 8.0软件进行分析、比较，发现2个处理材料的2-D电泳图谱十分接近，在蛋白质等电点为4.0～7.0，分子质量为8.0～100.0 ku 的双向电泳图谱上，分别平均鉴定出436与457个清晰的蛋白质点，2个处理的蛋白质点图谱匹配率达到 92%，大多数蛋白质点主要集中在15.0～94.0 ku、等电点在5.0～6.5，表明2个处理材料之间的蛋白质存在差异，但其表达数量和种类大致相同，仅有少量蛋白质发生了变化，这些差异蛋白可用于进一步分析研究。

2.2 玉米诱变系与原自交系蛋白质差异表达谱分析

本研究使用PDQUEST 8.0软件对自交系AMD16和经EMS诱变后选育材料苗期叶片蛋白质电泳图谱进行分析，共获得21个差异蛋白质点(图1)，其中5个蛋白质点在诱变后的选育材料中特异表达，7个蛋白质点上调表达，只有1个蛋白质点下调表达，并且2个差异蛋白质点仅在原自交系中表达，未在选育材料中表达；这些差异表达蛋白质点经MALDI-TOF-MS质谱测序，从21个差异表达的蛋白质点中成功测定出15个，运用MASCOT对其进行序列分析。图2显示了部分差异表达蛋白质点的局部放大图，有8个差异蛋白质点在2个不同材料中同时出现，其蛋白质点编号为1、2、3、5、8、15、17和18，其中蛋白质点1、2、3、5、15、17和18在诱变后代材料中呈上调表达，而蛋白质点8在诱变后代材料中呈下调表达；在诱变后代材料中呈特异表达的蛋白质点有5个，它们分别为14、20、21、22、和25，而蛋白质点19和23在原自交系中特异表达。

2.3 玉米诱变系与原自交系差异表达蛋白质点的质谱鉴定

在21个差异表达蛋白质点中，对其中的15个蛋白质点进行了质谱鉴定(表2)，而其他6个蛋白质点由于其蛋白丰度、蛋白酶切特性和得分不够未能鉴定出有意义的结果。功能分类表明，差异表达蛋白涉及生物细胞代谢/能量代谢、防御/抗胁迫、细胞蛋白合成和叶绿素合成等细胞过程；另外，还有4个未知功能的蛋白。其中，参与生物细胞代谢/能量代谢的蛋白质最多，其次是细胞蛋白合成类的蛋白。按照相应蛋白质点的等电点和匹配肽段的多少与得分进行分析后，从中确定了4个候选蛋白质点，分别为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、50S核糖体蛋白、β-D-葡萄糖苷酶和苹果酸脱氢酶(MDH)。

2.4 玉米ZmMDH6基因的克隆

采用植物总RNA提取试剂盒提取玉米幼苗叶片总RNA(图3)，以其反转录的cDNA为模板，利用ZmMDH6基因编码区的特异性引物进行PCR扩增，获得预期长度为1 296 bp的目的片段(图4)。将该片段与pMD19-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α，经菌液PCR检测获得阳性克隆,测序结果表明，获得由1 296 bp组成且序列正确的ZmMDH6编码区cDNA。该编码区蛋白由432个氨基酸残基组成，分子质量约为46.80 ku，等电点为5.79。

2.5 玉米半定量RT-PCR检测

为了确定玉米诱变系材料基因组中ZmMDH6基因是否表达量上升，将玉米β-Actin作为内参基因，以原自交系和诱变系的cDNA为模板，通过半定量RT-PCR方法分别对2个重复材料进行了检测，结果(图5)表明ZmMDH6在2个诱变系材料中都有较高水平的表达，但在2个原始自交系中表达量较低，2次重复试验的结果基本一致，确定该基因在玉米诱变系中呈上调表达，明确了观察到的MDH蛋白积累增多是基于其转录激活。因此可以将表达量较高的诱变系材料用于拟南芥转基因研究。

2.6 ZmMDH6植物表达载体的构建

利用内切酶BamHⅠ与XbaⅠ对含有ZmM-DH6基因编码区的cDNA片段和植物表达载体p3300进行双酶切，然后将酶切后的目的片段再用T4 DNA连接酶连接到植物表达载体p3300的CaMV35S启动子，转化到大肠杆菌DH5α中，分别进行菌液PCR 检测与质粒的酶切鉴定，均获得与预期大小一致的目的条带(图6和7)，结果证明其表达载体构建成功(图8)，并命名为p3300-ZmMDH6。通过冻融法转化到根癌农杆菌GV3101感受态细胞，挑取颜色、形状正常的单菌落摇菌，并进行菌液PCR鉴定，阳性克隆在-76 ℃保存备用。

2.7 拟南芥转化及阳性植株的检测和鉴定

用带有p3300-ZmMDH6载体的农杆菌菌液转化野生型拟南芥，收获拟南芥种子，得到T1代种子；将获得的T1代种子播种于小花盆中，3～4周后用筛选剂PPT对拟南芥幼苗进行喷雾筛选，因为本试验所使用的植物表达载体p3300上含有PPT抗性基因，因而在播种1周后未转化的野生型幼苗枯黄、死亡，而含有转基因成分的幼苗存活下来。将T1代种子经筛选剂PPT幼苗喷雾筛选后，得到了12株抗PPT的植株。对其中10株阳性克隆的株系进行基因组DNA的提取，利用ZmMDH6基因特异性引物进行PCR扩增检测，结果表明有9株得到了与预期目的片段大小一致的条带(1 296 bp)，初步表明其目的基因ZmMDH6已插入拟南芥植株的基因组DNA中(图9)。

将拟南芥转基因植株中呈阳性克隆的株系进行基因组DNA提取，利用植物表达载体p3300标记基因bar的特异性引物进行PCR扩增检测，以质粒为正对照，非转基因拟南芥植株为负对照。结果(图10)表明：在质粒正对照和3个转基因株系中均检测出与预期目的片段大小一致的条带(370 bp)，而非转基因植株中无该目的片段表达。表明含目的基因ZmMDH6的表达载体已成功插入拟南芥植株的基因组DNA中。

3 讨 论

3.1 玉米苗期叶片差异蛋白质的表达模式与功能

研究表明，在利用EMS-石蜡油诱变玉米成熟花粉的育种过程中，诱变后代材料的变异多发生于株高、叶宽等农艺性状的变异，并且其中的大部分变异属于基因的点突变[17]。在一般情况下，如果植物生长较快，其呼吸代谢强度也将增高，与代谢有关的酶类活性也升高；而生长较慢的植物其呼吸代谢强度偏低，相应酶类的活性也低[18]；植物呼吸作用产生的中间产物是合成蛋白质、脂肪和核酸等重要有机物的原料，因此呼吸作用直接影响植物体内各种物质的合成与转化[19]。本研究中，与原自交系相比，诱变后选育材料参与生物细胞呼吸代谢的差异蛋白质点的表达量均呈上调趋势，可能是随着植物生长发育的加快，表达量增加。同时，本研究中参与生物细胞蛋白合成的差异蛋白(蛋白质点21)为诱变后代材料的特异表达蛋白，而蛋白质点18为诱变后代材料的上调表达蛋白，这些蛋白可能参与了细胞蛋白的合成；而功能预测表明，蛋白质点2、5、14与15可能参与植物细胞的生长代谢活动，为植物生长发育提供更多的能量和中间产物，与玉米株高的改变和生物产量的提高有着密切联系。另几个未知蛋白质点1、8、17、19、20、22和25，一方面可能参与植物体内某些代谢活动；也可能与植物生长发育和干物质的积累有着密切关系。

3.2 玉米诱变与原材料候选蛋白质点的功能

在玉米EMS诱变育种研究过程中，诱变后代一般从M2代开始选择，成株期的质量性状发生明显变异的较少，但株高、穗位高和叶型等数量性状发生变化明显[20]。因此运用蛋白质组学进行分析，对了解玉米EMS诱变处理发生变化的原因及其对该过程的调节具有重要作用。

本研究中蛋白质点 2、14、15分别被鉴定为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)和烯醇化酶Ⅱ，与原自交系相比，在诱变后的选育材料中这些蛋白质点均呈上调趋势。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为生物体内糖酵解过程的一个重要酶，在各种生物体的细胞内能够催化甘油醛-3-磷酸进行氧化磷酸化成为1,3-二磷酸甘油酸[21-22]。通常认为，甘油醛-3-磷酸在进行氧化磷酸化过程中，GAPDH能够催化Cys149巯基和底物醛基形成半缩醛，而后脱氢再生成一个酰化酶，随之底物脱下的氢则被NAD+所接受[23]。同时，GAPDH如果在氧化胁迫条件下也可参与多种有利于糖分解与糖异生过程中的生理生化途径，将对植物的生长产生有利的影响。相关研究表明，苹果酸脱氢酶(MDH)可促进草酰乙酸盐氧化形成苹果酸盐，从而使植物体内的苹果酸含量增加，显著增强植物体的耐酸性以及对铝毒的抗性[24]。Gallardo等[25]在转化cpMDH基因的烟草研究中发现，当烟草中叶绿体MDH高表达时会促进植物体内L-苹果酸的增加，MDH表达量的高低也影响了植物的碳同化、代谢过程。本研究中，诱变后代从株高、穗位高和生物产量等数量性状上都发生了明显变化，这与刁钰婵等[20]的研究结果一致，同时也说明在生物细胞内相关酶类的变化以及表达量的高低直接影响植物的代谢和生长。

3.3 玉米诱变与差异候选基因ZmMDH6的功能

许云峰等[26]利用EMS诱变剂对小麦品种烟农15进行诱变处理，经过M2代和M3代筛选鉴定，得到11个农艺性状发生明显变异的突变系；徐艳花等[27]利用EMS诱变处理豫农201的小麦种子，对M2代植株进行农艺性状及其他生物学性状的表型筛选，并运用SDS-PAGE对突变体的高分子量麦谷蛋白亚基进行分析，得到了21个缺失不同类型亚基的突变体。研究表明，植物体内的苹果酸脱氢酶(MDH)是糖异生、光合作用、TCA循环以及多个穿梭系统中的关键酶类之一，其变化能够引起植物体内其他物质含量的变化，从而影响植物的抗胁迫应答[28-30]。张建斌等[31]对香蕉苹果酸脱氢酶基因进行克隆并对其逆境胁迫表达进行了研究，结果表明：MDH基因在植物耐盐、抗冷及延缓衰老等逆境中发挥着重要作用，并且MDH基因的高表达可使转基因植株ATP含量升高、呼吸速率加快，同时具有更高的抗氧化酶活性和较低的活性氧含量、相对电导率和MDH含量，说明苹果酸脱氢酶基因可以提高植物对盐害和冷害等非生物胁迫的抵抗能力，为植物生长发育提供足够多的能量，保证植物的正常生长发育从而提高产量。

本研究中的诱变后代材料在株高、叶宽及生物产量上明显高于其原自交系，同时苹果酸脱氢酶(MDH)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的蛋白质点的表达量均呈显著上调趋势。初步认为苹果酸脱氢酶(MDH )和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在诱变体中的上调表达可能是造成植株生长较快、生物产量较高的原因。贾晋等[32]对大白菜苹果酸脱氢酶基因进行克隆及序列分析研究，发现大白菜花蕾败育过程可能与其体内的苹果酸脱氢酶基因mRNA表达量下降有关，并获得了大白菜苹果酸脱氢酶基因cDNA的全长序列(1 209 bp)，该序列编码403个氨基酸；利用该序列推导的氨基酸序列与拟南芥中的苹果酸脱氢酶进行对比，发现其同源性为100%。 因此，本研究对苹果酸脱氢酶基因进行了分离、克隆，并构建植物表达载体，对野生型拟南芥进行遗传转化研究，为进一步研究该基因在玉米抗逆与增产中的作用奠定基础。

4 结 论

本研究通过对玉米经EMS诱变后的选育材料与原自交系苗期叶片总蛋白质组的比较分析，发现诱变后选育材料与原自交系叶片蛋白质组有明显的差异，而且生长发育较快的诱变后选育材料与原自交系差异蛋白质相比，大部分呈上调趋势，并有特异蛋白质出现；差异蛋白质分别参与生物细胞代谢/能量代谢、防御/抗胁迫、细胞蛋白合成及叶绿素合成等细胞过程；同时，玉米诱变系与原自交系在蛋白丰度上存在明显的差异；差异表达蛋白涉及到各个生长发育过程，可能与玉米生物产量的提高和株高的改变有密切关系。本研究进一步通过RT-PCR 方法克隆了差异候选基因ZmMDH6的编码框cDNA，获得了由1 296 bp组成且序列正确的ZmMDH6编码区cDNA，其编码蛋白由432个氨基酸残基组成，分子量46.80 ku，等电点5.79；将构建的植物表达载体成功转化野生型拟南芥，而且对已获得T1代转基因株系进行分子水平检测、鉴定，为进一步研究该基因在玉米抗逆与增产中的作用奠定了基础。

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Function analysis of proteomic and differential genes of plant height between mutagenic line and control inbred of maize

LÜ Er-suo1,LU Xiao-ping1,WANG Shu-yan1,XUE Chun-lei2,HAN Ping-an1,DONG Jing1,REN Rui2,LI Mei-na3

(1CollegeofAgronomy,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot,InnerMongolia010019,China; 2HuhhotHechuangAgricultureScientificResearchCenter,Huhhot,InnerMongolia011500,China;3HuhhotSeedManagementStation,Huhhot,InnerMongolia010020,China)

【Objective】 This paper studied the expression differences of mutagenic line and inbred line of maize through proteomic analysis to provide reference for improving plant height and biomass of mutagenic maize line.【Method】 The proteomic differences of mutagenesis and inbred line AMD16 were compared using two-dimensional gel electrophoresis (2-DE),MALDI-TOF-MS mass spectrometry and retrieval technology,and the candidate genes were separated and cloned to construct plant expression vector p3300-ZmMDH6 before being introduced intoArabidopsisand identified.【Result】 The proteome of mutagenic line contained 21 differentially expressed protein spots,including 5 specifically expressed spots,7 up-regulated spots and 1 down-regulated spots.Meanwhile there were two differences expressed in inbred line AMD16,but not expressed in the breeding materials.15 of them were identified as homologous to known proteins in the databases by MALDI-TOF-MS and MASCOT analysis,and its functions involved in biological cell metabolism/energy metabolism,defense/stress responses,protein synthesis in cells,and chlorophyll synthesis.The complete coding region cDNA ofZmMDH6 was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).The genes had the length of 1 296 bp and constituted 432 amino acid residues with molecular of 46.80 ku and pI of 5.79.The plant expression vector for the gene was constructed and introduced intoArabidopsis.The T1transgenic plants were identified by PCR.【Conclusion】 Protein abundance was significantly different between mutagenic line and inbred line of maize.The different expression of protein involved in all growth and development processes,indicating that it related to biomass and plant height.

maize (ZeamaysL.);proteome;MDH;gene cloning;gene expression

2014-10-31

内蒙古自治区科学技术项目(20131410)；内蒙古呼和浩特科学技术项目(2013-重-计-1)

吕二锁(1986-),男,内蒙古包头人,在读博士,主要从事作物遗传育种及生物技术研究。

逯晓萍(1960-),女,内蒙古呼和浩特人，教授,博士,博士生导师,主要从事作物遗传育种及生物技术研究。 E-mail:LXP1960@163.com

时间:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.006

S513.01

A

1671-9387(2015)06-0088-11

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1502.006.html