金黄垂直链霉菌HN6对香蕉的防病促生作用

王兰英，王 琴， 骆焱平

(1 海南大学 环境与植物保护学院，海南 海口 570228；2 辽宁省林业科学研究院，辽宁 沈阳 110032)

金黄垂直链霉菌HN6对香蕉的防病促生作用

王兰英1，王 琴2， 骆焱平1

(1 海南大学 环境与植物保护学院，海南 海口 570228；2 辽宁省林业科学研究院，辽宁 沈阳 110032)

【目的】 明确金黄垂直链霉菌HN6对香蕉的防病促生作用。【方法】 采用盆栽法，研究金黄垂直链霉菌HN6对香蕉枯萎病的防治效果及香蕉苗叶片PAL与SOD活性的变化，同时研究施加金黄垂直链霉菌HN6孢子悬浮液后，香蕉苗植株形态和生理指标的变化。【结果】 HN6对香蕉枯萎病的防治效果可达72.02%，极显著高于95%恶霉灵处理；与无菌水和95%恶霉灵相比，HN6能极显著提高香蕉苗的PAL与SOD活性。HN6可以增加香蕉苗株高、茎粗、地上部分鲜质量及地下部分鲜质量，提高植株叶片叶绿素、可溶性糖及可溶性蛋白质含量，有效增强植株根系活力，且与无菌水处理相比差异均达极显著水平。【结论】 109CFU/mL HN6孢子悬浮液灌根对香蕉具有很好的防病促生作用。

金黄垂直链霉菌HN6；香蕉枯萎病；防效；促生作用

香蕉枯萎病又名巴拿马病，由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubese,FOC)侵染引起，属国际检疫对象，该病的发生严重影响着香蕉种植业的发展。近年来，由于化学农药引起的农药残留、环境微生态被破坏等负面影响日益严重，使得利用有益微生物防治农作物病害的研究逐渐受到重视[1]。作为重要生防微生物资源的放线菌一直以来都是科研工作者关注的热点，链霉菌(Streptomyces)是放线菌中对植物病害具有重要防治作用的一个属，具有根际定殖能力强、次生代谢产物多样、对自然环境安全、易于规模生产与管理等优点[2]。Thandavelu等[3]发现，紫黑链霉菌产生的抗真菌代谢物对香蕉枯萎病4号小种具有良好的拮抗效果；Getha等[4]研究表明，链霉菌g10的胞外代谢产物对香蕉枯萎病原菌有较强的抑制能力；邱炜等[5]从土样中分离出DA07408，其对香蕉枯萎病菌具有较好的抑菌活性，初步鉴定为橄榄产色链霉菌；莫坤联[6]研究了不吸水链霉菌BWL58及白刺链霉菌BWL15-4对香蕉枯萎病的防效，并对2个菌株制剂进行了制备；秦涵淳[7]报道了1株拮抗链霉菌D4-4-L，其在田间小区试验中对香蕉枯萎病不仅有很好的防治作用，而且对香蕉也有一定的增产作用。综合上述研究结果可见，将链霉菌应用于香蕉枯萎病的防治切实可行。

许多研究表明，植物在防御植物病害入侵时，体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)等防御酶发挥着至关重要的作用[8-9]。而有些生防微生物不仅可以诱导植株这些防御酶活性的提高，甚至可以对植物生长产生一系列的促进作用，从而提高植物的抗病性[10-12]，因此开展这方面的研究对于揭示生防菌防病机理具有重要指导意义。本试验采用盆栽法，研究了金黄垂直链霉菌HN6对香蕉枯萎病的防治效果，以及香蕉苗叶片PAL与SOD活性的变化，同时研究了施加金黄垂直链霉菌HN6孢子悬浮液后香蕉苗植株形态和生理指标的变化，以期为该菌株的应用及防病机理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

靶标菌株：尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubense,FOC4)，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。生防菌株：金黄垂直链霉菌HN6(Streptomycesaureoverticillatus,HN6)，由海南大学环境与植物保护学院农药实验室提供。药剂：95%恶霉灵粉剂，北京北农绿享科技发展有限公司生产。香蕉苗：四叶期粉蕉(MusaABB)组培苗，由海南大学农学院提供。

1.2 方 法

1.2.1 孢子悬浮液的制备 将FOC4与HN6分别接种于PDA及高氏1号培养平板上，5 d后用无菌水洗脱孢子，同时用无菌水将FOC4和HN6孢子悬浮液分别稀释至107和109CFU/mL，备用。

1.2.2 HN6防效的测定 从非病原寄主种植地采集土样，过孔径85 μm筛，160 ℃灭菌2 h，冷却至常温后分装于灭菌育苗杯。用清水将香蕉苗根部冲洗干净，定植于育苗杯内，15 d后采用灌根法接入109CFU/mL HN6孢子悬浮液，分别以施加无菌水、95%恶霉灵粉剂1 200倍液为对照，每处理10株，重复3次。施加HN6孢子悬浮液5 d后，以伤根法接入107CFU/mL FOC4孢子悬浮液，然后于接种病原菌后第14，22，30 天调查各处理的病情指数，参照病情分级标准统计最终防效[13]。病情指数=[∑(发病植株数×病级数)/(总植株数×最高病级数)]×100；防效=(无菌水处理病情指数-其他处理病情指数)/无菌水处理病情指数×100%。

1.2.3 香蕉叶片PAL及SOD活性的测定 分别于施入FOC4孢子悬浮液后0(当天)，14，22和30 d，随机称取香蕉叶片1.0 g，加10 mL提取液(0.1 mol/L pH 8.8 硼酸缓冲液，1 mmol/L EDTA-Na2，1 g/L 聚乙烯吡咯烷酮)和0.1 g石英砂，在冰浴中研磨成匀浆，4 ℃、10 000 r/min 冷冻离心20 min，弃沉淀，取上清作为粗提液，置4 ℃冰箱中保存。PAL及SOD活性测定参照高俊凤[14]的方法进行。

1.2.4 HN6促生作用的测定 按照1.2.2节的方法种植香蕉苗。香蕉苗定植15 d后采用灌根法接入109CFU/mL HN6孢子悬浮液，以无菌水为对照。每处理10株，重复3次。于接种30 d时用直尺测定香蕉苗株高(地面到新叶根部的高度)，用游标卡尺测定香蕉苗茎粗(植株离地面土层3 cm的假茎茎粗)；将香蕉苗地上部和地下部切断，分别称量地上部和地下部鲜质量；按照李合生[15]的方法测定香蕉叶片叶绿素、可溶性蛋白质、可溶性糖含量及根系活力。

2 结果与分析

2.1 HN6对香蕉枯萎病的防效

由表1可知，接种FOC4后14 d，恶霉灵处理及无菌水处理的香蕉苗均出现病症，而HN6处理未发病；接种30 d时，无菌水处理到达发病盛期，病情指数达 81.42，HN6处理的病情指数最低，为22.78。依据30 d的病情指数计算防效可知，HN6防治效果明显，防效可达72.02%，与恶霉灵处理的差异达极显著水平。由此可见，HN6菌株对盆栽香蕉枯萎病有很好的防治作用。

注：同列数据后的小写字母表示α=0.05水平的差异显著性，大写字母表示α=0.01水平的差异显著性。下表同。

Note:Lowercase letter in each column shows significant difference atα=0.05,while capital letter shows extremely significant difference atα=0.01.The same for following tables.

2.2 HN6对香蕉叶片防御酶活性的影响

2.2.1 PAL活性 由图1可知：接种FOC4前(0 d)，HN6处理香蕉叶片的PAL活性极显著高于其他2个处理；接种病原菌后0～22 d，所有处理香蕉叶片PAL活性均呈增加趋势，其中HN6处理0～14 d增势平缓，14～22 d增势急剧；接种22 d时HN6处理香蕉叶片的PAL活性是无菌水处理的 2.7 倍，是恶霉灵处理的1.9倍，3种处理之间有极显著差异；接种病原菌后22～30 d，3种处理香蕉叶片的PAL活性均呈缓慢下降趋势，HN6处理及恶霉灵处理香蕉叶片的PAL活性均高于接种FOC4前(0 d)，而无菌水处理的PAL活性却低于接种FOC4前(0 d)。总体来看，测定时间内HN6处理香蕉叶片的PAL活性一直高于恶霉灵及无菌水处理，HN6对香蕉叶片PAL活性有明显的诱导效应。

2.2.2 SOD活性 由图2可知：经无菌水、HN6及恶霉灵处理后，香蕉叶片SOD的变化趋势与PAL相似。接种FOC4前(0 d)，HN6处理香蕉叶片的SOD活性极显著高于其他处理；接种病原菌 0～22 d，3个处理组香蕉叶片的SOD活性均呈明显增高趋势，其中以HN6处理的增幅最大，接种22 d时HN6处理香蕉叶片的SOD活性是无菌水处理的 1.6 倍，是恶霉灵处理的1.3倍，三者之间差异达极显著水平；接种病原菌22～30 d，3种处理香蕉叶片的SOD活性均呈下降趋势，此时的SOD活性均高于接种FOC4前(0 d)。总体来看，测定时间内HN6处理香蕉叶片的SOD活性一直高于恶霉灵及无菌水处理，HN6对香蕉叶片的SOD活性也有明显的诱导效应。

2.3 HN6对香蕉的促生作用

2.3.1 HN6对香蕉植株形态及根系活力的影响 由表2可知，施加HN6孢子悬浮液后，盆栽香蕉苗株高、茎粗、地上部分鲜质量、地下部分鲜质量均显著高于无菌水处理。相比较而言，HN6对植株株高影响最大，相对于无菌水处理增加了39.3%，总体来看，该菌株对香蕉植株形态指标的影响大小依次表现为：株高>茎粗>地上部分鲜质量>地下部分鲜质量；HN6处理的根系活力是无菌水处理的1.9倍，可见HN6可以显著增强香蕉植株根系对水分、养分的吸收能力。

2.3.2 HN6对香蕉叶绿素、可溶性糖及可溶性蛋白含量的影响 叶绿素是作物进行光合作用的主要原料，叶绿素含量越高，潜在的光合能力就越强。由表3可知，HN6处理香蕉苗叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量均高于无菌水处理，其中叶绿素a和类胡萝卜素含量差异达极显著水平；同时，HN6处理能明显提高叶绿素a/b值，可以有效提高植株光能转化率及光能利用率。说明HN6能极显著提高香蕉叶绿素总含量，增强香蕉幼苗光合能力，加强植株体内光合产物积累，促进植株生长。经HN6处理后，香蕉叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白质含量较无菌水对照处理增加了38.5%和29.9%，说明HN6也能显著提高香蕉可溶性糖、可溶性蛋白质含量。

3 结论与讨论

许多研究表明，经其他外源因素诱导或病原菌侵染后，植物体内的防御酶活性会有所变化[8]。本研究表明，盆栽香蕉苗经放线菌HN6孢子悬浮液处理后，在测定时间内香蕉叶片中的PAL及SOD活性均有所提高，且一直高于其他处理；接种病原菌后，HN6处理可以使植株发病时间得到延迟。可见HN6可能作为一个诱导因子，诱导植物体内PAL及SOD活性的变化，从而增强植株对病原菌的抵抗能力，延缓植株发病。这与周林[16]以及Saravanan等[17]报道的生防菌可以通过提高香蕉植株PAL及SOD等防御酶活性，增强植株抗病性的研究结果一致。同时本研究发现，接种病原菌后，所有处理在初发病时PAL及SOD活性均表现出明显增强的特点，可见病原菌也可以对植株防御酶起到一定的诱导作用。但这种诱导作用并不能使植株防御酶活性一直增强，在发病后期2种酶活性均呈下降趋势，相比较而言，HN6处理后酶活性的下降趋势最为缓慢，且2种酶的最终活性均高于初始值。推测其原因可能是随着寄主植物病情的扩展，其体内防御酶活性受到抑制，但受抑制程度不同，验证了齐希猛等[18]提出的病原菌对寄主防御酶活性先诱导后抑制的观点。

植物的生理生化等指标也与植物抗病性密切相关。叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其含量的高低直接关系到植物的干物质积累以及植物的抗病性[19-20]。可溶性糖是高等植物的主要光合产物，在植物代谢中占有重要位置。丁九敏等[21]、景岚等[22]的研究认为，可溶性糖作为新陈代谢的呼吸基质，其在叶片中的含量越高表明植株营养状态越好，抗病性越强；另外，生物体内的重要生物大分子——可溶性蛋白，不仅是生物体构建的重要组成成分，也是生物体内各种酶的组成成分[23]；同时，植物根系活力的高低直接影响着地上部的生长发育及其形态的建成，是根吸收、合成与生长等生理活动的综合表现[24]。本研究发现，供试菌株HN6的孢子悬浮液可以有效增加植株叶绿素含量，提高植株光能转化率及光能利用率，并可使可溶性糖、可溶性蛋白质含量分别较无菌水对照处理提高38.5%和29.9%，使香蕉植株根系活力较无菌水对照处理明显增强，可见菌株HN6对以上测定指标均表现出很强的正效应，这些正效应与植物抗病性密切相关。

综合本研究结果表明，HN6对香蕉有明显的防病促生作用，具有良好的开发应用前景。但本试验仅测定了该菌株对香蕉防病促生作用的部分指标，关于其防病的详尽机理还有待于进一步深入研究。

[1] 左艳霞,胡正嘉.1株抗水稻纹枯病放线菌的筛选 [J].华中农业大学学报,2006,25(1):60-63.

Zuo Y X,Hu Z J.Isolation and indentification of an actinomyces strain antagonistic againstRhizoctoniasolani[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2006,25(1):60-63.(in Chinese)

[2] Samac D A,WillertA M,McBride M J,et al.Effects of antibiotic-producingStreptomyceson nodulation and leaf spot in alfalfa [J].Appl Soil Ecol,2003,22:55-66.

[3] Thandavelu R,PaaniswamiA,Doraidwamy S,et al.The effect ofPseudomonasfluorescensandFusariumoxyaporumf.sp.cubenseon induction of defence enzymes and phenolics in banana [J].Bio Plantarum,2003,46(1):107-110.

[4] Getha K,Vikineswary S,Wong W H,et al.Evaluation ofStre-ptomycessp.strain g10 for suppression ofFusariumwilt and rhizosphere colonization in pot-grown banana plantlets [J].J Ind Microbiol&Biotechnol,2005,32(1):24-32.

[5] 邱 炜,黄惠琴,叶建军,等.抗香蕉枯萎病放线菌的筛选及菌株DA07408 的鉴定 [J].农业现代化研究,2009,30(1):126-128.

Qiu W,Huang H Q,Ye J J,et al.Screening of actinomycete againstFusariumoxysporumf.sp.cubenseand identification of strain DA07408 [J].Research of Agricultural Modernization,2009,30(1):126-128.(in Chinese)

[6] 莫坤联.抗香蕉枯萎病菌链霉菌菌剂制备及其防效测定 [D].海口:海南大学,2012.

Mo K L.Formulation of the antagonistic strains and its application to control banana wilt disease [D].Haikou:Hainan University,2012.(in Chinese)

[7] 秦涵淳.拮抗放线菌的筛选及其对香蕉镰刀菌枯萎病防治作用的研究 [D].海口:海南大学,2010.

Qin H C.Isolation of antagonistic actinomyces against bananaFusariumwilt disease and evaluation on their inhibition effects [D].Haikou:Hainan University,2010.(in Chinese)

[8] 徐沛东,常冬冬,兰 波.烯丙苯噻唑对水稻主要防御酶活性的影响及其对稻瘟病的防治效果 [J].华中农业大学学报,2014,33(4):60-65.

Xu P D,Chang D D,Lan B.Influence of probenazol on main defense enzymes in rice plants and its control efficacy against rice blast [J].Journal of Huazhong Agricultural University,2014,33(4):60-65.(in Chinese)

[9] 王 勇,周冬梅,郭坚华.蜡质芽孢杆菌AR156对辣椒的防病促生机理研究 [J].植物病理学报,2014,44(2):195-203.

Wang Y,Zhou D M,Guo J H.Disease preventing and growth promoting mechanisms ofBacilluscereusstrain AR156 on pepper [J].Acta Phytopathologica Sinica,2014,44(2):195-203.(in Chinese)

[10] 黄晓东,季尚宁,Bernard Glick,等.植物促生菌及其促生机理 [J].现代化农业,2002(7):12-15.

Huang X D,Ji S N,Glick B,et al.Plant growth promoting bacteria and mechanism [J].Modernizing Agriculture,2002(7):12-15.(in Chinese)

[11] 陈 杰,汤 琳,郭天文,等.马铃薯土传病原真菌拮抗放线菌的抗病促生作用 [J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2014,42(1):111-119.

Chen J,Tang L,Guo T W,et al.Resistances of actinomycetes against potato soil-borne pathogenic fungi and their promoting effects [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2014,42(1):111-119.(in Chinese)

[12] 陈 博,朱 军,孙前光,等.一株抗香蕉枯萎病内生细菌的分离鉴定及其抗病促生作用 [J].微生物学通报,2011,38(2):199-205.

Chen B,Zhu J,Sun Q G,et al.A bacterial endophyte from banana:Its isolation,identification,activity toFusariumwilt and PGPR effect to banana seedlings [J].Microbiology China,2011,38(2):199-205.(in Chinese)

[13] 许文耀,兀旭辉,林成辉.香蕉枯萎病防治剂的筛选 [J].福建农林大学学报:自然科学版,2005,34(4):420-424.

Xu W Y,Wu X H,Lin C H.Selection of the fungicides againstBananavascularwilt [J].Journal of Fujian Agriculture and Forestry University:Natural Science Edition,2005,34(4):420-424.(in Chinese)

[14] 高俊凤.植物生理学实验技术 [M].西安:世界图书出版公司,2000:203-204.

Gao J F.Experimental technique in plant physiology [M].Xi’an:World Book Publishing Company,2000:203-204.(in Chinese)

[15] 李合生.植物生理生化实验原理和技术 [M].北京:高等教育出版社,2000:119-120.

Li H S.Principles and techniques of plant physiological biochemical experiment [M].Beijing:Higher Education Press,2000:119-120.(in Chinese)

[16] 周 林.枯草芽胞杆菌TR21对香蕉枯萎病生防机制研究 [D].武汉:华中农业大学,2011.

Zhou L.Investigation on the biocontrol mechanism ofBaeillussubtilisstrain TR21 against bananaFusariumwilt [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2011.(in Chinese)

[17] Saravanan T,Muthusamy M,Marimuthu T.Development of in-tegrated approach to manage the fusarial wilt of banana [J].Crop Protect,2003,22:1117-1123.

[18] 齐希猛,易润华,曾 涛,等.海洋细菌TC-1对香蕉防御酶活性的影响 [J].中国农学通报,2012,28(1):223-227.

Qi X M,Yi R H,Zeng T,et al.Effect of antagonistic marine-born strain TC-1 on five major defensive enzymes in banana [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2012,28(1):223-227.(in Chinese)[19] 赵 娟,杜军志,薛泉宏.3株放线菌对甜瓜幼苗的促生与抗性诱导作用 [J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2010,38(2):109-116.

Zhao J,Du J Z,Xue Q H.The growth-promoting effect and resistance induction of 3 antagonistic actinomyces onCucumismeloL. [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2010,38(2):109-116.(in Chinese)

[20] 谢寅峰,蔡贤雷,刘伟龙,等.高氯酸盐对空心莲子草生长及叶绿素荧光参数的影响 [J].环境科学,2009,30(8):2425-2431.

Xie Y F,Cai X L,Liu W L,et al.Effects of perchlorate on growth and chlorophyll fluorescence parameters ofAlternantheraphiloxeroides[J].Environmental Science,2009,30(8):2425-2431.(in Chinese)

[21] 丁九敏,高洪斌.黄瓜霜霉病抗性与叶片中生理生化物质含量的关系的研究 [J].辽宁农业科学,2005(1):11-13.

Ding J M,Gao H B.Study on the relationship between resistance to cucumber downy mildew and the content of physiological-biochemical matter in the leaves [J].Liaoning Agricultural Sciences,2005(1):11-13.(in Chinese)

[22] 景 岚,王丽芳,康 俊.不同抗性的向日葵品种接种锈菌后叶片中可溶性蛋白、可溶性总糖及叶绿素含量的变化 [J].临沂师范学院学报,2008,30(6):76-80.

Jing L,Wang L F,Kang J.Changes of soluble protein,total sugar and chlorophyll in the leaves of different resistant sunflower varieties inoculated withPucciniahelianthiSchw. [J].Journal of Linyi Normal University,2008,30(6):76-80.(in Chinese)

[23] 郑海霞,王建明.西瓜枯萎病菌毒素培养滤液对西瓜幼苗可溶性蛋白含量的影响 [J].山西农业科学,2009,37(2):13-15.

Zheng H X,Wang J M.Toxic effects ofFusariumoxysporumextracts on the soluble protein content in watermelon seedling [J].Journal of Shanxi Agricultural Sciences,2009,37(2):13-15.(in Chinese)

Disease preventing and growth promoting effects ofStreptomycesaureoverticillatusstrain HN6 on banana

WANG Lan-ying1,WANG Qin2,LUO Yan-ping1

(1CollegeofEnvironmentandPlantProtection,HainanUniversity,Haikou,Hainan570228,China；2ForestryAcademyofLiaoningProvince,Shenyang,Liaoning110032,China)

【Objective】 This study investigated the disease preventing and growth promoting effects ofStreptomycesaureoverticillatusstrain HN6 on banana.【Method】 Control effect ofS.aureoverticillatusstrain against banana wilt was tested by potted method,and changes in PAL and SOD enzyme activities of banana leaves were detected.Furthermore,morphological and physiological indexes of banana seedlings were investigated after adding spore suspension of theS.aureoverticillatus.【Result】 The control effect ofS.aureoverticillatusagainstFusariumoxysporumwas up to 72.02%,extremely higher than that of 95% Hymexaxzol.S.aureoverticillatusextremely significantly increased PAL and SOD enzyme activities in banana leaves.S.aureoverticillatusalso increased banana seedling height,stem diameter,fresh weight,the contents of leaf chlorophyll,soluble sugar and soluble protein,and the vitality of root system extremely significantly compared to the control with sterile water.【Conclusion】 The disease preventing and growth promoting effects ofS.aureoverticillatuson banana seedlings were identified and the suggested concentration is 109CFU/mL.

Streptomycesaureoverticillatusstrain HN6;banana wilt;control effect;growth-promoting effect

2014-10-29

2014年度海南省应用技术研发与示范推广专项(ZDXM2014115)；海南省自然科学基金项目(314054)

王兰英(1976-)，女，山东郓城人，副教授，在读博士，主要从事生物防治研究。E-mail:daivemuwly@126.com

骆焱平(1973-)，男，湖北鄂州人，教授，博士，主要从事生物农药研究。E-mail:yanpluo@126.com

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.008

S476.11

A

1671-9387(2015)05-0163-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.008.html