椎间盘退变细胞及分子疗法研究进展＊

胡 松，罗兴燕，刘 阳，邹 强

成都医学院 科研实验中心（成都 610083）

正常椎间盘（intervertebral disc，IVD）既承载着人体外力负荷，同时又保证了脊椎的灵活性。IVD的相关组织包括纤维环（annulus fibrosus，AF）、髓核（nucleus pulposus，NP）及软骨终板，这种结构决定了IVD是细胞结构少、无血管、低氧和低营养的酸性环境。机械损伤、营养供应、细胞活性、机制成分及新陈代谢等因素导致IVD组织脱水、纤维化、神经和血管向内生长，最后导致组织损失和IVD突出。本文拟将近年来针对IVD疾病的细胞和分子疗法作一综述。

1 引言

根据Global Burden of Disease Study最新公共健康报道，全球约有6.32亿人受腰背痛影响，其中IVD突出比例为10%～15%，并呈上升趋势。腰背痛也是导致残疾的原因之一［1］。

1.1 正常IVD的结构与功能

IVD属于多层次器官，包括中心的NP、包裹NP的AF，以及起到连接脊椎作用的软骨终板［2］。NP的功能为吸收脊椎受到的机械压力。AF的主要功能是对NP释放的渗透压提供张力作用。小分子可以渗透软骨终板，为IVD细胞提供营养物质［3］。细胞的低密度和大量的胞外基质（extracellular matrix，ECM）适合于厌氧代谢，进而导致低氧含量及高乳酸盐含量和低pH水平。

1.2 IVD的退变机制

NP中蛋白聚糖的流失伴随组织脱水并最终使组织纤维化。AF则可能发生裂纹，结构能力减弱使得NP发生突出。腰痛和腿痛的原因在于相邻的神经受到来自脱出NP的压力或刺激［4］。病变被认为是遗传因素和外在致病条件间的复杂相互作用，其中遗传因素发挥着重要作用，大量结合基质蛋白或代谢介质基因改变的研究说明其能增加IVD退变的风险。因此，了解上述方面及定位疼痛来源对疾病的针对性治疗至关重要。

2 IVD特殊微环境特征

IVD复杂的解剖结构为脊柱提供了灵活性和外力吸收能力。NP、AF和软骨终板的特殊结构为细胞提供了独一无二的微环境，是IVD中重要的无血管结构。营养素和代谢物能通过液体流通或扩散经终板和AF抵达IVD中心。IVD的其他特性包括低细胞结构和细胞流动性低、pH低和含大量多糖。进一步定义这种特殊环境结构是后续研究的必要基础，并且在研究新疗法时，须考虑如何保存原有结构。

3 体内平衡重建中的细胞补充

3.1 IVD细胞移植

过去20年，通过自体软骨细胞移植修复软骨的方法已经建立，然而移植方法似乎很难运用于IVD，因为通过活检方式取IVD细胞并不可行，穿刺健康IVD易导致其退变［5］。少数细胞可以取自于IVD摘除术或脊柱融合术，但这些细胞似乎并不健康且有老化可能。不过，已有研究表明，IVD细胞移植安全且有助于减低疼痛。为了提高IVD细胞在基质中的增殖能力和活力，将从IVD组织中分离的细胞与间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）共培养。短期共培养在没有染色体异常和肿瘤发生的情况下可显著提高人NP细胞生长和蛋白多糖合成［6］。最新研究［7］表明，NP细胞的低温储藏具有可行性；冷藏细胞和新鲜细胞在增殖和基质产物上没有显著区别，使不从手术过程获得移植细胞的可能性大大增加。

3.2 MSCs移植与再生机制

注射MSCs作为IVD细胞和软骨细胞的替代细胞，在动物模型和临床上已有广泛研究。脂肪组织衍生MSCs对IVD的修复能力是已知的，但骨髓却是MSCs获取的最大来源［8］。10个腰IVD退变患者通过NP内注射给药接受 MSCs［9］，可安全、迅速地改善疼痛，其效果与脊椎融合术、IVD置换术不相上下，但MSCs对退变IVD的修复机制还未完全阐明。由于NP细胞的表型和形态学观察与软骨细胞相似，所以软骨细胞标记分子如Sox-9、aggrecan和typeⅡcollagen已被普遍用于分析和评估分化得来的IVD样细胞。虽然已有关于IVD细胞特异性标记物的研究，但仍不确定骨髓和脂肪组织衍生的MSCs是否能分化成具有天然表型的NP细胞。另外，通过诱导细胞产生的新基质修复IVD的机制也不明了。但是MSCs的修复能力在很大程度上可能是因为其通过旁分泌刺激、细胞间接触或细胞膜成分交换，从而活化NP细胞［10］。注射MSCs后，可能因为MSCs的抗炎作用，也可能因为其合成代谢方面的效应，会使疼痛得到长期缓解。

3.3 细胞运载系统

移植细胞保留、活化和分化能力需要适当的细胞运载系统。用于细胞运载和IVD组织工程的天然与合成聚合物支架以及水凝胶的研究已经展开。由于NP的高含水量结构，注射水凝胶系统不仅提供了结构支撑，也很适合细胞的运用和保持。虽然水凝胶在提升细胞功能上得到大多数人的认可，但其机械性能还不能完全满足机械支撑的需求。如需承受快速和直接的负荷，那么组织替换材料则需要更强韧的机械性能。柔软的水凝胶包括纤维、胶原、透明质酸和壳聚糖等，运用于退变早期时只有少量结构会发生变化。目前较推荐的是Ⅱ胶原和透明质酸的交联物质，它们可作为NP退变时的注射物质［11］。最近发现，在体外研究和器官培养中［12］，稳定的纤维－透明质酸聚合物可促进产生能与组织整合的NP细胞基质。由此，透明质酸因对治疗性细胞所具有的生物载体性质而被考虑广泛运用。

3.4 祖细胞归巢

为了避免细胞移植风险，再生细胞迁移至损伤位置作为不同的观点已有研究。在自然修复过程中，受损细胞和组织释放信号吸引祖细胞回到损伤位点。归巢所需特殊趋化分子取决于组织修复及生长因子、细胞因子和趋化因子［13］。进一步研究显示应答不良营养、压力负荷及穿刺时，IVD释放趋化分子并增加骨髓衍生干细胞迁移。IVD分泌的趋化因子CCL5/RANTES和CXCL6是体外研究时补充 MSCs的关键因子［14］。此外，用IL-1和 TNF－α处理NP细胞，趋化因子CCL3表达上调，这些趋化因子可能提高祖细胞归巢和巨噬细胞对IVD浸润［15］。因此，适当平衡补充细胞或趋化因子在调节细胞和基质比例上面起重要作用。

4 生物活性因子/基因运输

4.1 蛋白/小分子运输

为了重建退化早期生理平衡，递送生物因子动员或活化细胞可能比自体或异体细胞移植更直接。IVD退化和疼痛发生相关机制已有报道，且已有疗法在体内注射生长因子，包括成骨蛋白1（osteogenic protein 1，OP-1）和 生 长 分 化 因 子（growth and differentiation factor 5，GDF-5）及小分子［16］。富含血小板血浆（PRP）或血小板溶解物也包含多种生长因子和蛋白，能增强细胞生长和功能，有助于组织修复。多种体外和体内研究［17］显示，PRP对IVD再生具有阳性效果，然而在递送生物因子的同时也应该研究如何防止炎症、血管生成和骨生成。

4.2 基因递送系统

与单纯注射蛋白相比，基因疗法更具有持久性优势。IVD中已有研究的治疗性基因可以编码代谢合成 因 子 （BMPs、GDF-5、LMP-1）、转 录 因 子（Sox-9）［18］、炎症拮抗剂（IL-1Ra）［19］或金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）［20］。目前有病毒性和非病毒性两类基因传递载体，大部分研究则使用腺病毒作为载体。有报道以腺病毒为载体递送基因GDF-5［21］或BMP诱导蛋白（lim mineralization protein 1，LMP-1）［22］，可在IVD中增加基质沉积并修复其功能。然而，感染和产生免疫反应是病毒性基因传送系统附带的潜在风险。非病毒性基因传递系统则更加安全，但其最大缺点是基因传递效率太低，目前在IVD中只有少数报道使用非病毒传递系统。最近更多的研究者［23］致力于高效非病毒基因递送方法，因而非病毒性基因递送有望成为治疗IVD的优势疗法。

5 胞内信号通路疗法

多种胞内信号通路在IVD细胞退变中已有研究。胞内信号通路是保持体内环境平衡通信系统的重要部分，并且大部分信号通路在不同细胞中都有相似作用。对于IVD中特异信号通路的研究目前成为热点。氧浓度、机械应力和炎症因子等通过细胞因子或生长因子都可以活化IVD细胞内信号通路。

5.1 NF-κB和MAPK信号通路

主要信号通路NF－κB和 MAPK调节促炎介质，如 TNF－α、IL-1β及IL-6，并且已有鉴定［24］表明，两种通路在肌肉骨骼疾病中是炎症和分解代谢的主要调控因子。抑制NF－κB信号通路已被考虑可用于治疗IVD突出或联合性疼痛。最近在老化相关IVD退变中，已有研究［25］使用药物和基因阻断NF－κB信号通路。大鼠IVD突出模型中［26］，当 NF－κB诱导寡聚脱氧核苷酸被局部控制于背根神经节时，大鼠机械触痛和热痛觉过敏出现显著抑制。Ercc1小鼠可用于抑制NF－κB，NF-κB抑制则可通过基因敲除或是通过腹膜注射药物Nemo Binding Domain（8K-NBD）。8K-NBD可封闭 NF－κB上游活化因子IκB诱导激酶（IKK）的形成。相比幼龄野生型小鼠，早衰样Ercc1小鼠盘内NF－κB活化被显著提高，并且衰老表现与野生型小鼠自然衰老相似。NF-κB活化的上调与IVD中蛋白聚糖含量相关，Ercc1小鼠中通过8K-NBD封闭NF－κB信号，增加IVD中蛋白聚糖积累，缓解IVD细胞和基质疾病。

MAPK在IVD中也同样被认为可作为抗炎和抗分解代谢的靶点。使用IL-1β诱导炎性因子或分解代谢时，加入姜黄素后可显著下调IL-6、MMP1、MMP3和 MMP13的水平。潜在信号通路分析［27］显示，TLR2表达的下调和MAPK/JNK的抑制，可活化p38和ERK。此外，靶激酶的抑制疗法可显著增加蛋白聚糖含量、合成和释放［28］。

5.2 Wnt信号通路

Wnt信号通路作为IVD疾病中的相关介质已有描述。Wnt信号通路分为 Wnt/β－连环蛋白依赖和非β－连环蛋白依赖两类，后者又进一步分为二维细胞极性通路和Ca2＋通路［29］。用Wnt活化剂LiCl处理NP细胞可加速细胞老化［30］。此外，对IVD中不同信号通路的相互作用研究［31］表明，使用LiCl处理NP细胞导致β－连环蛋白在mRNA和蛋白水平中上调；同时原癌基因（c-myc）和细胞周期蛋白D1的抑制可活化 Wnt/β－连环蛋白通路，从而下调细胞增殖。另有研究检测β－连环蛋白条件（cAct）小鼠中的分解代谢基因表达，观察显示在β－连环蛋白基因敲除小鼠IVD细胞中，MMP13和ADAMTS5基因表达上调，与IVD退变特征相符。此外，cAct小鼠IVD的退变可通过抑制MMP13进行阻断，提示β－连环蛋白是保持IVD功能与结构的基础因子［32］。

6 小结与展望

过去10年，IVD退变的生物疗法在分子医学技术和理论方面都有很大进展。随着IVD疾病特性相关理论的积累，将有更多更好的疗法能运用于不同类型的IVD退变疾病中。内源性修复的提升和功能性干细胞归巢可能阻止IVD退变的发生。相对于异种NP，干细胞疗法有IVD特异性祖细胞性状，并可能发挥更大效应。在基础动物研究的临床化中，药物疗法将继续作为重要治疗手段使用。胞内信号通路的持续性研究将为更多信号通路疗法提供治疗靶点，从而调节IVD细胞及体内平衡保持系统。

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