胶质母细胞瘤干细胞研究进展及其在胶质瘤治疗中的作用＊

杨卉慧，赵旭东

中国科学院 昆明动物研究所（昆明 650223）

胶质母细胞瘤干细胞（GSC）具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能等特性。GSC的发现、分离并证实其存在，是胶质瘤研究中的重大突破；它对胶质母细胞瘤的形成、生长、浸润、转移、复发及治疗敏感性起决定性作用［1］，也为靶向治疗提供了新的思路。

1 GSC概念的提出以及起源

自上世纪50年代进行的肿瘤细胞移植实验［2］到后来众多研究均发现，只有在免疫缺陷小鼠中植入较大量的肿瘤细胞才能形成移植瘤。传统理论对此的解释是，尽管每个肿瘤细胞都可以无限制地生长、形成新的肿瘤，但每个肿瘤细胞形成肿瘤的几率都很小，因此需要移植较多数量的肿瘤细胞才能成瘤；另一种观点认为，肿瘤中有一部分细胞具有自我更新能力，并能产生异质性肿瘤细胞，只有这种细胞才能形成新的肿瘤，即肿瘤干细胞学说［3］。肿瘤干细胞概念最早在上世纪60年代提出，但一直因无直接实验证据未能获得广泛认可［4］。上世纪90年代，Lapidot和Bonnet等［5－6］首先在急性髓细胞白血病（AML）中分离鉴定了一类具有干细胞特性的肿瘤细胞，证明了肿瘤干细胞的存在。Reya等［7］随后对其他肿瘤干细胞的特征进行了较全面的预测。2003年终于在实体瘤乳腺癌［8］和脑瘤［9－10］中发现了具有类似特性的细胞。

得益于成熟的正常神经干细胞的分子标记研究和分离培养技术，Singh等［9］从儿童肿瘤死亡率居首位的髓母细胞瘤中，分离培养了可形成神经球样的细胞，这些细胞表达神经干细胞分子标记物CD133。2004年，同一研究小组从儿童髓母细胞瘤和成人胶质母细胞瘤中分离出了类似的细胞，并证明了CD133＋细胞具有自我更新能力，可分化为神经元、星形胶质细胞和寡树突状胶质细胞样的细胞，少量此类细胞就可在免疫缺陷的动物中成瘤并重现原肿瘤的分子和病理特征，从而确认了GSC的存在。

目前，肿瘤干细胞已被证明存在于乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、皮肤癌以及肾癌等许多类型肿瘤中，并具有以下基本特征：自我更新能力、分化形成异质性肿瘤细胞的能力，以及在体内重现原肿瘤的组织学特征、分子遗传特征的能力［11］。这一理论为我们重新认识肿瘤的起源和本质，以及临床肿瘤治疗提供了新的方向和视角。根据这一理论，肿瘤干细胞虽然数量少，却在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着重要作用，理应是癌症研究和治疗的主要靶点细胞［12－14］。清除动物模型中的肿瘤干细胞可以阻止肿瘤发展［15］，但肿瘤干细胞对放疗、化疗的耐受性高［16－17］，这也成为肿瘤复发和转移的主要原因。因此研发对肿瘤干细胞有良好效果的新型抗癌药物具有重要价值。

对于GSC的起源目前主要存在两种假设。1）GSC起源于神经干细胞。由于GSC和神经干细胞具有非常类似的分子特征和生物学特性，而大脑的脑室下区是神经干细胞主要存在的区域，同时有研究发现胶质母细胞瘤的发生与脑室下区存在密切的联系［18］。Holland等［19］向胶质纤维酸性蛋白阳性细胞和巢蛋白阳性细胞中导入癌基因，结果发现巢蛋白阳性细胞产生肿瘤的几率显著高于胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。综上研究提示GSC是神经干细胞恶性转化而来。2）祖细胞或成熟星形胶质细胞可以通过基因突变、遗传性状改变等再次激活调控自我更新的通路，从而提高自我更新能力，形成肿瘤。目前上述假设仍不能完全解释GSC的起源，GSC的起源问题有待今后进一步研究。

2 GSC的生物学特性

2.1 体外培养条件下的生长特性

Singh等［9］以CD133为标志物，从不同类型的胶质瘤组织中，分离出胶质瘤干细胞，并进行体外培养。在含有生长因子的无血清条件下，GSC呈悬浮样生长，并且可以维持自我更新和增殖。Lee等［20］对不同培养条件下临床样品分离的GSC的遗传学、基因表达谱等进行分析发现，肿瘤干细胞在长期培养过程中，除神经球样生长外还可维持遗传学和表达谱等特征稳定。Pollard等［21］将 GSC培养在laminin包被的培养皿中，发现和神经干细胞类似，GSC在laminin基质上也生长良好，并可长时间维持肿瘤干细胞特性，为GSC用于高通量药物筛选提供了有利条件。

2.2 GSC的异质性

由于肿瘤干细胞本身就是一个异质性的群体，因此肿瘤干细胞的存在反映了整个肿瘤细胞群体在增殖能力和分化程度上的异质性。Gerlinger等［22］对实体瘤的大规模测序分析证实，在个体肿瘤中也存在广泛的异质性。GSC作为一类肿瘤干细胞群体，可能也存在多方面的异质性，这种异质性不仅体现在不同胶质母细胞瘤的干细胞之间，也可体现在同一GSC群体的内部。

2.3 自我更新和无限增殖特性

与神经干细胞相比，肿瘤干细胞的自我更新和增殖能力都明显强于神经干细胞［23－26］。目前认为，检验肿瘤干细胞自我更新和无限增殖能力的金标准是动物体内成瘤实验［27］。Singh等［9］证实：接种100个从胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤分选出的CD133＋细胞，便可在免疫缺陷型小鼠体内形成移植瘤，而且再次向免疫缺陷型小鼠体内接种从移植瘤内分离的肿瘤干细胞，又可形成表型相同的移植瘤。与之相比，接种105个CD133－的肿瘤细胞却未能成瘤。这一研究充分说明胶质母细胞瘤内肿瘤干细胞虽然数量少，却是肿瘤发生、生长和复发的原动力。

2.4 多向分化潜能和致瘤性

在除去生长因子或添加血清后，体外培养的GSC能贴壁生长并发生分化，产生的肿瘤细胞可分别表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标志物［28－29］，因此GSC具有类似神经干细胞的多向分化潜能。然而不同于神经干细胞的是，GSC分化产生的肿瘤细胞一般会有成熟障碍，并且部分细胞可同时表达神经元和胶质细胞的标志物，表明GSC的分化机制紊乱，这种异常的分化现象说明GSC是一种恶性转化细胞［28－29］。Singh等［9］将从胶质母细胞瘤中分离得到的肿瘤干细胞异体移植入免疫缺陷型小鼠脑中，发现新生成肿瘤与原肿瘤极为相似；应用免疫组化方法检测，发现新生成肿瘤与原肿瘤组织均表达能够反映细胞未分化状态的标记物巢蛋白，以及干细胞分化后的神经元标记物β微管蛋白，且两种组织之间各标记物表达程度相当，表明新生成肿瘤分化形成的组织与原肿瘤表型相同。

2.5 抗放射性和抗药性

根据肿瘤干细胞学说，很容易想到清除肿瘤干细胞可以达到治疗肿瘤的目的，但肿瘤干细胞对常规放化疗具有较高耐受性［15－16］。Bao等［30］对人 胶质母细胞瘤中提取出的肿瘤干细胞进行放射敏感性实验，结果表明，CD133＋细胞比CD133－细胞更能优先激活射线所致DNA损伤的检验点，并能有效修复射线诱导的DNA损伤。此外，应用检验点激酶Chk1和Chk2的特异抑制剂，可逆转由CD133＋细胞产生的抗放射性。另有研究显示，抑制部分DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位复合体，则可间接抑制DNA双链修复，提高对射线的敏感性，从而为减少胶质母细胞瘤的抗放射性提供了一种新思路［31］。GSC的放射抗性不仅与DNA的修复能力相关，而且与细胞周期调控、凋亡和增殖的信号传导通路改变等相关。

CD133＋细胞的体内实验发现，GSC和神经干细胞一样，几乎处于休眠状态，停滞于细胞周期中的G0／G1期［32］，这种状态可以使其逃避常规的放疗和化疗。另外脑肿瘤干细胞能高表达腺苷三磷酸结合盒转运体，可以将多种药物转运出细胞外，因此对化疗产生耐药性［33］。Liu 等［34］发现，CD133＋细胞的O6－甲基鸟嘌呤－DNA甲基转移酶（MGMT）表达水平显著高于CD133－细胞；GSC的耐药性还可能与其高度表达抗凋亡的基因有关。因此，针对GSC耐药性的各个环节进行干预，可以增强甚至恢复GSC对化疗的敏感性，逆转其耐药性。

2.6 GSC与微环境

与正常的干细胞一样，肿瘤细胞也有独特的微环境，两者的关系相辅相成，即肿瘤干细胞有助于微环境的维持，微环境亦能维护干细胞的自我更新［35］。Li等［36］认为干细胞微环境的异常调控导致了干细胞增殖失控，进而可导致肿瘤发生。在肿瘤干细胞微环境内，不断发生着一些保持自身内环境稳定的反应，如炎症、上皮间质转化（EMT）、缺氧以及血管新生等，这些生物过程决定肿瘤干细胞的命运。

而GSC微环境中的微血管增殖是胶质母细胞瘤的一个重要特点。胶质母细胞瘤病理级别越高，肿瘤干细胞越多，其微血管结构也越多，三者呈正相关［37］。Calabrese等［37］通过使用多光子激光扫描电子显微镜和免疫荧光共染法研究GSC的过程中，发现肿瘤组织切片中被标记的干细胞距离毛细血管要比普通肿瘤细胞近得多。在体外，与单独培养GSC相比，与内皮细胞混合培养的GSC生长速度更快，并且普通的胶质母细胞瘤细胞与内皮细胞混合培养也没有增殖加快的现象［38］。说明GSC与微环境中的其他细胞及成分之间有着紧密的联系。

2.7 GSC与肿瘤血管形成

恶性胶质母细胞瘤是人体血管化程度最高的肿瘤，血管的生成和增长在胶质母细胞瘤生长和侵袭过程中起重要作用，并与其恶性进展有关。肿瘤血管新生的过程是由许多因素共同决定，其中血管表皮生长因子和血管内皮细胞起到了重要的作用。

血管表皮生长因子（VEGF）的主要作用是增加血管内皮细胞的迁移和促进血管新生。Bao等［39］在体内成瘤试验中发现，GSC形成的肿瘤与普通肿瘤细胞移植形成的肿瘤在病理特征和表型上都有明显的差异。GSC移植形成的肿瘤血管丰富，坏死和出血也比普通的肿瘤要多［39］。进一步的研究表明，GSC能维持VEFG（低氧环境下）的高水平表达［40］，因此GSC是以VEGF为基础来调节肿瘤血管的生成的。

多年来，人们一直认为肿瘤血管主要由正常血管内皮细胞构成，但是最近研究发现，胶质母细胞瘤中血管内皮细胞具有与肿瘤细胞相同的遗传变异特性，提示这些血管内皮细胞可能是肿瘤来源的（肿瘤细胞或肿瘤干细胞）［39］。体外研究［41－42］证实，GSC可分化为血管内皮细胞，在小鼠模型中特异性去除肿瘤干细胞来源的血管内皮细胞，可明显抑制肿瘤血管形成及肿瘤生长。因此GSC可以通过维持VEGF的表达和分化为血管内皮细胞，调节肿瘤血管的形成。

2.8 GSC与肿瘤恶性等级和预后的关系

因为胶质瘤干细胞能特异性表达CD133和巢蛋白，因此对不同级别、不同病理类型的人胶质母细胞瘤样本进行CD133、巢蛋白免疫组织化学染色，结果表明，肿瘤的恶性程度与CD133和巢蛋白的表达量成正相关，即胶质母细胞瘤恶性等级越高，CD133、巢蛋白的表达越强，患者的预后就越差，生存率就越低［43］，说明GSC的数量与肿瘤恶性程度和病人预后密切相关。

3 GSC的临床意义

3.1 GSC在临床诊断和预后中的作用

由于肿瘤起源于肿瘤干细胞，因此要做到真正的早诊断就必须尽早发现体内的肿瘤干细胞，甚至在出现临床表现前就发现它。此外，肿瘤生长及扩散转移速度的快慢和侵袭能力的强弱体现了GSC自我更新、增殖、分化和迁移能力的大小，即GSC决定了胶质母细胞瘤的临床恶性程度。若GSC的自我更新、增殖、分化和迁移能力较强，则临床表现为肿瘤生长速度快，容易向周围组织侵袭和转移，肿瘤的恶性程度高，患者的预后差；反之亦然［44］。

GSC在肿瘤的侵袭扩散中起着重要的作用。一方面，肿瘤干细胞的一个重要特性就是迁移性；另一方面，干细胞缺乏人类白细胞抗原，移植后可长期存活于受体的多种组织中［45］，GSC可能也缺乏人类白细胞抗原，可以在向其他组织侵袭转移的过程中逃逸，以逃避免疫系统的监视，避免免疫细胞的攻击，所以GSC存活的可能性比较大。

3.2 GSC在肿瘤治疗中的作用

传统理论认为，肿瘤细胞具有无限增殖能力，因此针对肿瘤细胞的治疗方法有外科手术、化疗和放疗等，而肿瘤体积是否缩小或消失是衡量治疗效果的标准之一。但是许多肿瘤，尤其是胶质母细胞瘤，经过一段时间的治疗后又会复发，不能从根本上延长病人的生存期，主要原因在于目前的治疗方法均不能有效彻底杀死GSC，特别是已经发生扩散的GSC。GSC决定了肿瘤的恶性程度和是否容易扩散转移，并且它对化疗和放疗的耐受性远远比普通肿瘤细胞强。动物模型研究［15］证实，清除肿瘤干细胞可以阻止肿瘤发展，因此高效准确的去除GSC，在肿瘤的治疗中有至关重要的作用。

4 依据GSC治疗胶质瘤的方法

4.1 肿瘤干细胞与药物的发现

显而易见，靶向肿瘤干细胞的药物对治疗肿瘤有更好效果，但目前的抗肿瘤药物都是用肿瘤细胞系筛选出来的，对肿瘤干细胞效果甚微。利用GSC进行药物筛选有一系列优势：1）大规模筛选抗肿瘤干细胞药物的基本要求是扩增培养肿瘤干细胞，以获得足够细胞。GSC是最早分离鉴定的实体瘤干细胞之一，也是极少数能体外长期培养的肿瘤干细胞之一，在肿瘤干细胞研究中具有重要的示范意义。2）GSC除了可悬浮培养形成类似神经球样的细胞团外，也可长期贴壁传代培养，极有利于高通量筛选［46］。3）与在含血清的培养基中进行胶质母细胞瘤原代细胞培养不同，GSC基因组和基因表达谱在长期培养条件下都极稳定［20］。因此GSC是目前筛选抗肿瘤干细胞药物的理想选择。

近年来，GSC开始用于抗肿瘤干细胞药物筛选［47－49］，但这些研究存在一些明显的缺陷：1）仅能筛选细胞毒性化合物，无法判断药物对肿瘤干细胞的分化作用。而根据肿瘤干细胞理论，除细胞毒性药物可杀死肿瘤干细胞外，诱导肿瘤干细胞分化的药物也应对肿瘤治疗有理想效果。2）用于筛选的肿瘤干细胞没有进行遗传变异检测，筛选结果不一定具有广泛适用性。3）用于筛选的细胞中没有报告基因，给高通量筛选带来不便。本实验室用GSC建立了高通量筛选平台，并用于天然产物库、经典药物分子库等的筛选，获得了一系列结果。

4.2 诱导分化疗法

根据肿瘤干细胞学说，除了传统的杀死干细胞的药物外，诱导GSC分化从而失去自我更新能力的药物，也将具有良好的抗肿瘤效果。Kang等［50］用小分子CG500354处理GSC，发现CG500354通过细胞周期调节因子、p53、p21、p27和特殊的周期蛋白等，诱导细胞增殖的停滞并分化为表达Tuji和胶质纤维酸性蛋白的细胞，使GSC处于增殖停滞且分化正常的状态。

4.3 免疫疗法

特异性针对GSC的免疫靶向治疗策略，是利用其干细胞独特的免疫源性，通过启动机体免疫系统，并产生各种具有生物活性的物质来调节和改善人体的免疫功能，抑制和杀死肿瘤细胞。

胶质母细胞瘤的免疫治疗主要包括肿瘤疫苗疗法、细胞因子疗法、过继免疫细胞疗法以及抗体免疫疗法等。其中，肿瘤疫苗疗法中的树突状细胞瘤苗（DC vaccine）疗效最佳、应用最广［51－53］。Pellegatta等［54］首次尝试将DC疫苗靶向GSC，他们从小鼠胶质母细胞瘤细胞系GL261中富集GSC，并对DC进行抗原负载，制成的DC疫苗与普通GL261细胞负载的DC疫苗相比，组织相容性复合物（MHC）和共刺激分子的表达上升，激活的效应T细胞对肿瘤溶解杀伤的能力增强；负载GSC的DC疫苗能更有效地提高荷瘤小鼠的生存期、治愈率以及瘤内CD4＋／CD8＋T细胞浸润。临床I、II期试验中，应用树突状细胞瘤苗法后，患者的生存率及生存期得到了显著的提高，且没有出现副作用与自身免疫反应，显示出其在胶质瘤治疗中的巨大应用前景［55］。

4.4 靶向干细胞信号通路

一些重要的信号转导通路，如对细胞定向分化起调控作用的Hh通路、Notch通路，以及细胞外信号调节激酶等，它们的异常均可直接或间接引起胶质母细胞瘤的发生，因此针对这些信号通路进行干预，则可起到促进GSC的分化、抑制肿瘤细胞生长的作用。

Hh通路的异常激活和下游转录因子Gli1的增加，均被证实是肿瘤产生的重要驱动因素。胰岛素样生长因子依赖于Hh／Gli1通路的激活，而阻断Gil1通路足以限制胰岛素受体底物－1（IRS1）的蛋白表达，以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化，从而抑制GSC的增生，限制肿瘤的发生和发展，一定程度上抵消了GSC对替莫唑胺的抗药作用［56］。Notch通路直接介导细胞间的相互作用，在肿瘤发生过程中，对脑肿瘤干细胞的增殖分化有重要的调控作用。用γ－分泌酶抑制剂（GSI）阻断该通路，以评估其对GSC的作用，结果表明经过该抑制剂处理的GSC，在增殖及自我更新的能力上均有减弱，且有分化为成熟神经元的趋势，表明该通路抑制剂GSI可以作为针对GSC靶向治疗胶质母细胞瘤的一种有效手段［57］。

4.5 基因疗法

胶质母细胞瘤的发生发展涉及到许多基因的调控，从分子水平上对GSC的基因进行改造，将影响胶质母细胞瘤的增殖、凋亡等一系列生物学行为。

进行干细胞的转基因治疗，目前常用的是胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）／甘环鸟苷（GCV）自杀基因治疗方法。将I型单纯疱疹病毒编码TK的基因插入合适的病毒载体，而TK可以将抑病毒药物GCV转化为有毒性作用的代谢产物。带有自杀基因的病毒载体可以在表达载体细胞（VPC）中扩增。将VPC注入大脑后释放载体，病毒对感染肿瘤干细胞有较高选择性，并不对周围的正常组织造成损伤。转入核内的TK基因产物在胞浆内累积。注射核苷类似物甘环鸟苷后，在TK作用下GCV转变为具有毒性作用的三磷酸甘环鸟苷。三磷酸甘环鸟苷通过抑制DNA聚合酶的活性及错误插入复制的DNA链中，以阻断DNA合成，诱导干细胞死亡或凋亡［58－59］。

也有研究表明Nrf2是调节抗氧化应答元件基因表达的关键因子［60］，而在基因和蛋白质层次上，Nrf2在GSC中的表达都明显高于胶质母细胞瘤细胞系［61］。Nrf2在GSC功能的调节中起重要作用，例如促血管生成途径和细胞凋亡等。利用反义基因疗法人工合成出与GSC Nrf2mRNA序列互补的反义核酸，将其导入GSC中，通过碱基配对与互补链杂交，影响Nrf2mRNA的翻译过程，抑制其编码蛋白质的合成，从而抑制GSC基因的表达及增殖，使其进入正常化轨道或引起其凋亡，从根源上消除胶质母细胞瘤的发生或复发［62］。

5 问题与展望

越来越多的研究表明，GSC在肿瘤发生发展中起着关键作用。GSC为胶质母细胞瘤研究和治疗提供了全新视野，很大程度上拓展了人们对胶质瘤发生、发展以及放化疗耐受机制等方面的认识，有望带来突破性进展。但有关GSC的研究还有诸多问题亟待解决，如缺乏GSC的分子标记和针对GSC的药物等。

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