高产脂肪酶菌株筛选

吴慧昊 ，陈 强，钟 琦 ，付信磊，陈俊楠

(1.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)

高产脂肪酶菌株筛选

吴慧昊1，陈 强2，钟 琦2，付信磊2，陈俊楠2

(1.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)

以实验室所提供的12株酵母菌菌株为试验对象，进行活化和扩大培养，通过初筛及复筛，筛选出高产脂肪酶菌株，并采用酸碱滴定法测定酶活力.经过选择培养基复筛选出6株透明圈较大的菌株，对其测定酶活.结果表明，菌株CC06具有较高的脂肪酶活性，脂肪酶活力为31.67 U/mL.

脂肪酶；菌株筛选；酶活力

微生物脂肪酶，又称三酰基甘油酰基水解酶，是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶.本世纪初发现微生物脂肪酶以来，由于其种类多，具有比动物脂肪酶更广的作用，且pH值、作用温度范围和对底物的专一性便于进行工业生产 ，而得到广泛关注和研究[1].

微生物脂肪酶催化反应是：甘油三酸脂+水→甘油二酸脂+游离脂肪酸→甘油酸脂+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸.脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行.

随着现阶段人们对微生物的重视程度越来越高，有关微生物脂肪酶研究也不断深入.最近几十年，随着工业化应用对脂肪酶性质的不同需求，能够产生具有特定酶学性质的脂肪酶微生物种类不断增加，目前遍及酵母菌属、霉菌属等[2～3].但大部分脂肪酶菌株的酶催化效率不高，对于脂肪酶高产菌的研究正在不断深入.

1 材料与方法

1.1 材料

实验室传代保存的12株酵母菌菌株.

1.1.1 试剂

对硝基棕榈酸苯酯(p-NPP)、2%聚乙烯醇(简称PVA，聚合度1750)、pH7.5磷酸缓冲液、0.05 mol/L NaOH标准溶液、橄榄油、95%乙醇、10 g/L酚酞指示剂.

1.1.2 培养基

油脂培养基：每升含 10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 gNaCl、10 g花生油、1 mL 1.6%中性红水溶液、17.5 g琼脂.用0.1 mol/L NaOH 调节pH至7.2.

麦氏琼脂培养基：每升含1 g葡萄糖、1.8 g KCl、2.5 g酵母浸膏、8.2 g醋酸钠、17.5 g琼脂.

复筛培养基：每升含1 g(NH4)2SO4、1 gK2HPO4、0.5 gKCl、0.1 gMgSO4·7H2O、10 g橄榄油、1 g聚乙烯醇、17.5 g琼脂.用0.1 mol/L NaOH调节pH至8.5.

脂肪酶验证培养基：每升含10 g蛋白酶、5 gNaCl、0.1 gCaCl2·7H2O、17.5 g琼脂.用0.1 mol/L NaOH调节pH至7.4.

选择性培养基：每升含0.5 g(NH4)2SO4、0.5 gNaCl、0.2 gMgSO4·7H2O、0.5 g 酵母粉、17.5 g琼脂.用0.1 mol/L NaOH调节pH至7.2.将上述溶液灭菌冷却至60 ℃左右加入均压后的2%聚乙烯醇橄榄油乳化液 ( V 橄榄油︰V 2%聚乙烯醇 = 1︰3)，用紫外灯照射灭菌30 min以上备用.

1.2 方法

1.2.1 菌株活化留种

将实验室中置于4 ℃冰箱下的12株菌株取出，接种于液体麦氏培养基，并于超净工作台内画斜面，确保菌体不被污染.活化完毕，将菌株置于37 ℃恒温培养箱进行培养.

1.2.2 产脂肪酶菌株的初筛

将实验室提供的12株菌株在油脂培养基平板上划线培养48 h，观察是否长出红色菌株，筛选并留种.

1.2.3 产脂肪酶菌株的复筛

将经过初筛的10株菌株，活化后取接种针点种于配制好的选择性培养基中(注：培养基聚乙烯醇必须与橄榄油彻底交融)，置37 ℃恒温培养箱培养48 h，观察所长菌落周围有无透明光圈，利用测微尺测定光圈直径与菌落直径，记录数据并挑选直径比大的菌株进行酶活力测定.

1.2.4 脂肪酶活力测定

采用酸碱滴定法测定脂肪酶活力[4].测定原理：脂肪酶在一定条件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单脂和甘油，所释放的脂肪酸可用标准溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点.根据消耗的量，计算其酶活力，反应式为：RCOOH + NaOH →RCOONa + H2O.

酶活力单位：在37 ℃水浴条件下，每分钟分解底物产生1 μmol脂肪酸所需的酶量定义为一个脂肪酶活力单位(U).

2 结果

2.1 产脂肪酶菌株的初筛

脂肪酶验证培养基常用来验证所选菌株是否产生脂肪酶，在经过培养后若培养基呈红色，表明该菌株能产生脂肪酶.如图1所示，初筛共筛选出6株菌株具有产脂肪酶能力.

表1 产脂肪酶菌株的初筛结果

2.2 产脂肪酶菌株的复筛

聚乙烯醇选择性培养基能够挑选出菌株中产酶能力较高的菌株，利用透明光圈和菌落的直径比大小能很清晰地了解菌株的产酶能力.直径比越大的表示其产酶能力越高.实验所得结果见表2.

表2 菌株复筛结果

2.3 酶活力测定

选取6株复筛菌株，采用滴定法进行酶活力测定，由表3可知编号为CC06菌株的酶活力最高，为31.67 U/mL，其余菌株酶活力较低，酶活力测定与复筛结果基本一致.

表1 菌株酶活力测定值

3 结论

通过实验分析结果表明，复筛选出6株透明圈较大的菌株，酶活力大小分别为: CC06>XZ>AC03>ZC006>ZC005>ZC004；产脂肪酶活力最好的菌株是CC06，其酶活力的大小为31.67 U/mL.

脂肪酶可以催化油脂选择性水解与其他酯类的转酯、氨解等反应，是一种重要的工业用酶，被广泛应用于油脂水解、食品风味的改进、医疗医药、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性等[5].近年来还大量用作生物柴油制备过程中的催化剂，酶法生产生物柴油技术具有产物提取简单、反应条件温和、甘油容易回收和无废物产生等优点[7～10].另外，HanSoojin 等[11]发现不动杆菌属的细菌所产的胞外脂肪酶具有甲醇耐受性，而对乙醇则不耐受.这一点使该菌脂肪酶在用于酯化反应生产生物柴油方面具有一定的应用潜力.由此可见，选育高产脂肪酶菌株将对工业生产具有更高层次的实际意义.

[1] 张树政.酶制剂工业(下册).脂肪酶[M].北京:科学出版社,1998.655-670.

[2] Macrae A, Hammond R. Present and future applications of lipases[J]. Biotechnology& Genetic Engineering Reviews,1985,3: 193-217.

[3] 曹茜,冯凤琴.微生物脂肪酶的研究进展及其在食品中的应用[J].中国食品学报,2013,10:136-141.

[4] 郭冉冉.高产脂肪酶菌株的筛选及酶学性质研究[J].西南大学,2010,4:20-21.

[5] 刘海洲,刘均洪,张媛媛,等. 微生物脂肪酶的最新应用研究进展[J].食品研究与开发,2009,309(1):141-143.

[6] 宋玉卿,刘春雷,于殿宇,等.酶法催化大豆油脚脂肪酸制备生物柴油的研究[J].食品工业,2008,4:58-61.

[7] 张呈平,杨建明,吕剑.生物柴油的合成和使用研究进展[J].工业催化,2005, 13(5):9-13.

[8] 尚喜雨.产脂肪酶酵母的筛选及菌种鉴定[J].安徽农业科学,2010,38(20)：10511-10514.

[9] 李俊锋.耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶酶学性质[J].食品科学,2012,33(03)：116-120.

[10] 王松.碱性脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件的优化[J].西南大学学报(自然科学版),2010,32(6):99-103.

[11] Han SJ,Back JH,Yoon MY,et al.Expression and characterization of a novel enantioselective lipase from acinetobact er species SY-01[J].Biochimie,2003,85(5):501-510.

2015-11-20

国家民委科研项目 (No.14XB2015);西北民族大学本科生开放实验项目.

吴慧昊(1985—)，女，甘肃甘南人，实验师,主要从事微生物营养方面的研究.

Q933

A

1009-2102(2015)04-0051-03