磷脂酶A2-ⅡA亚型基因rs11677 C/T多态位点基因突变及蛋白表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关联性研究

翟艳春，魏文强，何 燕，李新庆，王 嵬，刘 芬



磷脂酶A2-ⅡA亚型基因rs11677 C/T多态位点基因突变及蛋白表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关联性研究

翟艳春，魏文强，何 燕，李新庆，王 嵬，刘 芬

目的 探讨磷脂酶A2-ⅡA亚型(PLA2G2A)基因中的单核苷酸多态性(SNP)rs11677 C/T多态位点基因突变及蛋白表达与食管鳞状细胞癌(ESCC)临床病理特征的关系。方法 选取2009年10月—2010年9月河南省林州市食管癌高发区，首次经组织病理学确诊的食管ESCC患者260例，血液标本采用MassArray时间飞行质谱生物芯片检测PLA2G2A基因rs11677 C/T位点基因型；采用免疫组织化学染色方法(SP法)检测癌及癌旁组织中PLA2G2A蛋白的表达情况。比较不同临床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T阳性率及PLA2G2A蛋白表达阳性率，不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率。结果 260例食管ESCC患者中PLA2G2A基因rs11677 C/T多态位点CC型 66.2%(172/260)、CT+TT型 33.8%(88/260)。携带CC基因型者PLA2G2A蛋白表达阳性率(56.4%，97/172)与携带CT+TT基因型者(55.7%，49/88)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同年龄、组织学分化、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。不同年龄、组织学分化、TNM分期、淋巴结转移食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；不同浸润深度食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。不同rs11677C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.149，P=0.928)。结论 未发现PLA2G2A基因 rs11677 C/T多态位点基因突变与其蛋白表达的相关性，PLA2G2A蛋白表达与食管ESCC浸润深度相关。

食管肿瘤；癌,鳞状细胞；Ⅱ型磷脂酶A2；多态性,单核苷酸

翟艳春，魏文强，何燕，等.磷脂酶A2-ⅡA亚型基因rs11677 C/T多态位点基因突变及蛋白表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关联性研究[J].中国全科医学，2015，18(12)：1396-1400.[www.chinagp.net]

Zhai YC,Wei WQ,He Y,et al.Correlation among PLA2G2A rs11677 C/T polymorphism,protein expression and clinicopathologic features of esophageal squamous cell carcinoma[J].Chinese General Practice，2015，18(12)：1396-1400.

食管癌是一种常见的人类消化道恶性肿瘤，其5年生存率为10%～15%[1]。食管癌的病理类型包括鳞状细胞癌(ESCC)和腺癌2种类型，我国食管癌90%是ESCC[2]。磷脂酶A2-ⅡA亚型(PLA2G2A)被报道在人类多种肿瘤中有表达，包括结肠癌、胰腺癌及前列腺癌[3]，并且在炎性反应、血管生成及肿瘤发生发展过程中发挥重要作用[4]。本研究采用MassArray时间飞行质谱生物芯片检测PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型在ESCC患者中的分布情况，结合免疫组织化学方法检测PLA2G2A蛋白表达情况，探讨PLA2G2A基因rs11677 C/T多态位点基因突变及蛋白表达的临床意义，为食管ESCC的诊治提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2009年10月—2010年9月河南省林州市食管癌高发区，首次经组织病理学确诊的食管ESCC患者260例，收集手术切除癌及癌旁组织(患者术前均未接受化疗、放疗或其他任何相关的肿瘤治疗)标本以及静脉血2 ml。其中，血标本进行PLA2G2A基因rs11677 C/T多态性检测，癌组织及癌旁组织进行免疫组织化学染色检测。260例食管ESCC患者中，男182例，女78例；年龄33～79岁，中位年龄60岁；分化程度：高分化45例、中分化124例、低分化91例；肿瘤分期：Ⅰ期37例、Ⅱ期127例、Ⅲ期89例、Ⅳ期7例；淋巴结转移118例、无淋巴结转移142例。

1.2 试剂 PLA2G2A兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam公司，超敏SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。引物由北京赛百盛生物工程公司设计，Enzyme、Buffer、dNTP购自Mannheim公司，树脂购自Sequenom公司。

同行评议：

本研究探讨了磷脂酶A2-ⅡA亚型(PLA2G2A)基因rs11677 C/T多态位点基因突变及其蛋白表达与食管鳞状细胞癌(ESCC)的关联性，为阐明ESCC的遗传易患性提供了新的理论依据。本研究设计严谨，资料齐全，有一定创新性，有指导和参考价值。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色SP法 按照北京中杉金桥生物技术有限公司SP免疫组织化学试剂盒操作说明书进行。常规切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢10 min阻断内源性过氧化物酶的活性，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)高压抗原修复10 min，冷却至室温。牛血清清蛋白封闭50 min，加入PLA2G2A兔抗人多克隆抗体(一抗)(ab23705,1∶200；Abcam,Cambridge,MA,USA)，湿盒孵育4 ℃过夜。次日室温复温，加入二抗孵育60 min。二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，盐酸-乙醇分色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，阳性对照切片由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，PLA2G2A蛋白反应为棕黄色颗粒定位于细胞质。

1.3.2 MassArray时间飞行质谱生物芯片测定单核苷酸多态性(SNP) 利用MassArray Assay Design(Sequenom) 软件设计引物，上游引物为5′-ACGTTGGATGACCTCAACTCCGTGCTTAAC-3′，下游引物为5′-ACGTTGGATGGGCAATGCATACACACACAC-3′。引物合成后，所有DNA样本稀释到10～50 ng/μl，取1 μl将其与1.8 μl水、0.5 μl PCR、0.4 μl 氯化镁(MgCl2)、0.1 μl dNTP、1 μl PCR 引物混合在一起。PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；共45个循环；最终72 ℃ 5 min，降温至25 ℃。对上步的PCR产物进行SAP酶消化，该反应在37 ℃进行40 min，然后85 ℃ 5 min使酶失活；降温至25 ℃。该步完成之后，将消化后的产物进行单碱基延伸反应，条件如下：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；52 ℃ 5 s；80 ℃ 5 s；5个内部循环；72 ℃ 3 min。共40个外部循环；降温至25 ℃。结束上述反应后，将产物进行树脂纯化，将所有产物中的盐离子清除。将最终的分型产物点样到芯片上，进行MALDI-TOF质谱检测。最后结果由MassArray RT软件系统实时读取，并通过软件系统完成基因分型分析。

1.4 结果判定 免疫组织化学结果由2名病理学专家独立进行判读，结果采用半定量方法。判定标准如下：+阳性细胞数<5%;++阳性细胞数5%～30%；+++阳性细胞数>30%。统计分析时阳性细胞数≥5%判定为阳性，<5%判定为阴性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0软件包进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型与蛋白表达的相关性 260例食管ESCC患者中PLA2G2A基因rs11677 C/T多态位点CC型66.2%(172/260)、CT+TT型33.8%(88/260)。携带CC基因型者PLA2G2A蛋白表达阳性率(56.4%，97/172)与携带CT+TT基因型者(55.7%，49/88)比较，差异无统计学意义(χ2=0.12，P=0.913)。癌组织免疫组织化学检测发现，PLA2G2A蛋白表达阳性呈棕黄色颗粒状，主要分布于细胞质中，而正常组织中无阳性表达(见图1)。

注：A为食管ESCC癌组织，B为正常组织

图1 食管ESCC癌组织与正常组织PLA2G2A免疫组织化学染色 (×400)

Figure 1 PLA2G2A immunohistochemical staining in ESCC tissues and normal tissues

2.2 不同临床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型频率比较 不同年龄、组织学分化、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 不同临床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型频率比较〔n(%)〕

Table 1 Comparison of the positive rates of PLA2G2A rs11677 C/T among ESCC patients groups with different clinical features

临床特征例数基因型CC TT+CTχ2值P值年龄(岁)0.1200.729 ≤503019(63.3)11(36.7) >50230153(66.5)77(33.5)组织学分化0.2560.880 高4529(64.4)16(35.6) 中12481(65.3)43(34.7) 低9162(68.1)29(31.9)TNM分期1.0960.778 Ⅰ3725(67.6)12(32.4) Ⅱ12781(63.8)46(36.2) Ⅲ8962(69.7)27(30.3) Ⅳ74(57.1)3(42.9)淋巴结转移0.2600.610 无14292(64.8)50(35.2) 有11880(67.8)38(32.2)浸润深度2.3640.500 T14430(68.2)14(31.8) T23722(59.5)15(40.5) T3176117(66.5)59(33.5) T433(100.0)0

注：PLA2G2A=磷脂酶A2-ⅡA亚型

2.3 不同临床特征食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较 不同年龄、组织学分化、TNM分期、淋巴结转移食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；不同浸润深度食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.4 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.149，P=0.928，见表3)。

3 讨论

在中国，食管ESCC是食管癌主要病理类型，大约占所有食管癌的90%[5]，是侵袭性极强并且预后很差的肿瘤之一。在中国北部，尤其是靠近太行山一带，食管ESCC在癌症致死疾病中占首位[6]。食管癌的发病因素很多，目前公认吸烟、饮酒、对食管造成损伤的各类慢性刺激及环境因素是中国食管ESCC高发的主要原因。调查发现，喜吃烫食、超量饮酒、低收入、低体质指数、既往食管病变、不按时就餐、喜食辣食及肿瘤家族史等均是增加食管癌患病风险的因素[7-8]。近年来，与食管ESCC发生、演化相关的基因水平的研究越来越受到人们的重视。已有研究表明，PLA2G2A在食管ESCC癌组织和食管正常组织中的表达存在差异[9]。

表2 不同临床特征食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较〔n(%)〕

Table 2 Comparison of the positive rates of PLA2G2A protein expression among ESCC patients groups with different clinical features

临床特征例数PLA2G2A蛋白阳性 阴性χ2值P值年龄(岁)1.2400.266 ≤503016(53.3)14(46.7) >5023098(42.6)132(57.4)组织学分化0.8830.643 高4517(37.8)28(62.2) 中12455(44.4)69(55.6) 低9142(46.2)49(53.8)TNM分期6.7170.081 Ⅰ3723(62.2)14(37.8) Ⅱ12752(40.9)75(59.1) Ⅲ8935(39.3)54(60.7) Ⅳ74(57.1)3(42.9)淋巴结转移1.4150.234 无14267(47.2)75(52.8) 有11847(39.8)71(60.2)浸润深度10.3600.016 T14428(63.6)16(36.4) T23711(29.7)26(70.3) T317674(42.0)102(58.0) T431(33.3)2(66.7)

表3 不同rs11677 C/T基因型食管ESCC患者PLA2G2A蛋白表达阳性率比较〔n(%)〕

Table 3 Comparison of the positive rates of PLA2G2A protein expression among ESCC patients groups with different rs11677 C/T genotypes

rs11677C/T基因型例数PLA2G2A蛋白阳性 阴性CC17297(56.4)75(43.6)CT7340(54.8)33(45.2)TT159(60.0)6(40.0)

磷脂酶A2(PLA2) 是一类能催化水解磷脂Sn-2 位脂肪酸磷酸甘油酯酰基酯键形成游离脂肪酸及溶血磷脂的酶族。PLA2主要有4种类型:分泌型、胞质型、非钙离子依赖型及脂蛋白相关型；其中分泌型磷脂酶A2(sPLA2)包括约10种亚型，ⅡA亚型(sPLA2-ⅡA)主要来源于非胰腺组织，如白细胞、血小板和胎盘等[10]。人类的sPLA2-ⅡA首先从类风湿患者的滑膜液中发现并分离获得[11]。在其免疫防御功能得到肯定的同时，作为花生四烯酸代谢通路上游的第一个限速酶，sPLA2-ⅡA与消化系统肿瘤癌前病变、细胞增殖、血管侵袭和肿瘤转移等关系的研究取得了一定的进展[12-13]。1997年，Cormier研究小组首次发现PLA2G2A具有对抗小鼠肠管肿瘤发生和增殖的功能[13]。然而研究结果显示，PLA2G2A基因并不像传统的抑癌基因那样发挥作用，在人类前列腺癌中PLA2G2A发挥促癌基因的作用[14]，在晚期胃癌患者中PLA2G2A的表达与其存活存在正相关[15]，这就表明在不同类型的消化系统肿瘤中或者在不同的理化条件下，PLA2G2A对肿瘤所发挥的作用存在着一定的差异，有时甚至相反[16]。

本课题前期的研究表明，PLA2G2A基因rs11677 C/T多态位点基因突变与食管ESCC风险有关，与携带与CC基因型者比较，携带CT+TT基因型者食管ESCC发病风险降低[17]。本研究结果显示，携带不同基因型者PLA2G2A蛋白表达阳性率无差异。另外，PLA2G2A蛋白表达与食管ESCC临床特征关系中，除不同浸润深度间存在差异外，其他临床特征间均无差异。不同临床特征食管ESCC患者PLA2G2A基因rs11677 C/T基因型间均无差异。

综上所述，本研究未发现PLA2G2A基因rs11677 C/T多态位点基因突变与其蛋白表达的相关性，但PLA2G2A蛋白表达与食管癌浸润深度相关。研究结果仍需更多大样本、多中心研究进一步验证。

[1]Fred F.Ferri′s clinical advisor[M].Louis：Elsevier Mosby,2012：389-391.

[2]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[3]Buhmeida A,Bendardaf R,Hilska M,et al.PLA2(group ⅡA phospholipase A2) as a prognostic determinant in stage Ⅱ colorectal carcinoma[J].Ann Oncol,2009,20(7):1230-1235.

[4]Murakami M,Taketomi Y,Sato H,et al.Secreted phospholipase A2 revisited[J].J Biochem,2011,150(3):233-255.

[5]Li LW,Li YY,Li XY,et al.A novel tumor suppressor gene ECRG4 interacts directly with TMPRSS11A(ECRG1) to inhibit cancer cell growth in esophageal carcinoma[J].BMC Cancer,2011,11:52.

[6]Qi YJ,Chao WX,Chiu JF.An overview of esophageal squamous cell carcinoma proteomics[J].J Proteomics,2012，75(11):3129-3137.

[7]Sun YL,Zhang JQ,Mao YH.Epidemiological study of risk factors for esophageal cancer in Yangquan Area of Shanxi Province based on discordant sib pairs[J].World Chinese Journal of Disgestology,2010,18(16):1708-1713.(in Chinese) 孙玉琳,张金强,毛永红.山西省阳泉市表型不一致同胞对的食管癌调查[J].世界华人消化杂志,2010,18(16):1708-1713.

[8]Yang L,Wang SK,Sun GJ.A case-control study on the risk factors for esophageal cancer[J].Tumour,2009,29(3):249-252.(in Chinese) 杨磊,王少康,孙桂菊.食管癌危险因素的病例对照研究[J].肿瘤,2009,29(3):249-252.

[9]Ren P,Zhang JG,Xiu L，et al.Clinical significance of phospholipase A2 groupⅡA(PLA2G2A) expression in primary resected esophageal squamous cell carcinoma[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(6):752-757.

[10]Schaloske RH,Dennis EA.The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system[J].Biochim Biophys Acta，2006，1761(11):1246-1259.

[11]Seilhamer JJ,Pruzanski W,Vadas P,et al.Cloning and recombinant expression of phospholipase A2 present in rheumatoid arthritic synovial fluid[J].J Biol Chem，1989，264(10):5335-5338.

[12]Yanaru-Fujisawa R,Matsumoto T,Kukita Y,et al.Impact of phospholipase A2 group Ⅱa gene polymorphism on phenotypic features of patients with familial adenomatous polyposis[J].Dis Colon Rectum，2007，50(2):223-231.

[13]Cormier RT,Hong KH,Halberg RB,et al.Secretory phospholipase PLA2G2A confers resistance to intestinal tumorigenesis[J].Nat Genet，1997，17(1):88-91.

[14]Graff JR,Konicek BW,Deddens JA,et al.Expression of group Ⅱa secretory phospholipase A2 increases with prostate tumor grade[J].Clin Cancer Res,2001，7(12):3857-3861.

[15]Leung SY,Chen X,Chu KM,et al.Phospholipase A2 group ⅡA expression in gastric adenocarcinoma is associated with prolonged survival and less frequent metastasis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(25):16203-16208.

[16]Birts CN,Barton CH,Wilton DC.Catalytic and non-catalytic functions of human ⅡA phospholipase A2[J].Trends Biochem Sci,2010，35(1):28-35.

[17]Liu F,Wei WQ,Cormier RT,et al.Association of single nucleotide polymorphisms in the prostaglandin-endoperoxide synthase 2(PTGS2) and phospholipase A2 group ⅡA(PLA2G2A) genes with susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(4):1797-1802.

(本文编辑：陈素芳)

Correlation Among PLA2G2A rs11677 C/T Polymorphism,Protein Expression and Clinicopathologic Features of Esophageal Squamous Cell Carcinoma

ZHAIYan-chun,WEIWen-qiang,HEYan,etal.

DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,SchoolofPublicHealth,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China

Objective To investigate the correlation among the phospholipase A2 group ⅡA(PLA2G2A) gene single nucleotide polymorphism(SNP)(rs11677 C/T),the protein expression and the clinicopathologic characteristics of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods A total of 260 ESCC patients from Linzhou city,Henan province,an area of high incidence of esophageal cancer,were selected as study subjects from October 2009 to September 2010,ESCC was confirmed by histopathologic examination for the first time.Blood specimens were used to detect the PLA2G2A rs11677 C/T SNP genotype by time-of-flight mass spectrometry MassArray system,and the carcinoma and pericarcinous tissues were used to examine the expression of PLA2G2A protein by immunohistochemical SP method.The positive rates of PLA2G2A rs11677 C/T and PLA2G2A protein expression were compared among different groups of ESCC patients with different clinical features,the positive rates of PLA2G2A protein expression were compared among different groups of ESCC patients with different rs11677 C/T genotypes.Results Among 260 ESCC patients,the distribution of CC,TT+CT genotype of PLA2G2A rs11677 C/T SNP was 66.2%(172/260) and 33.8%(88/260),respectively.There was no significant difference in the positive rate of PLA2G2A protein expression between cases with CC genotype(56.4%,97/172) and cases with CT+TT genotype(55.7%,49/88)(P>0.05).The genotypes rate of PLA2G2A rs11677 C/T did not vary by age,histological differentiation,TNM stage,lymphatic metastasis and depth of invasion of ESCC(P>0.05).The positive rate of PLA2G2A protein expression did not vary by age,histological differentiation,TNM stage and lymphatic metastasis(P>0.05).There was no significant difference in the positive rate of PLA2G2A protein expression among ESCC patient groups with different rs11677 C/T genotypes(χ2=0.149，P=0.928).Conclusion The correlation between PLA2G2A rs11677 C/T polymorphism and the PLA2G2A protein expression is not significant,while PLA2G2A protein expression is closely related to the depth of invasion of ESCC.

Esophageal neoplasms；Carcinoma,squamous cell；Group Ⅱ phospholipases A2；Polymorphism,single nucleotide

国家自然科学基金资助项目(81473056,30901239)；北京市自然科学基金面上项目(7132023)；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目(CIT&TCD201404183)

100069北京市，首都医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京市临床流行病学重点实验室(翟艳春，何燕，王嵬，刘芬)；中国医学科学院肿瘤医院流行病室(魏文强，李新庆)

王嵬，100069北京市，首都医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京市临床流行病学重点实验室；

E-mail:wei6014@yahoo.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.12.010

2014-12-16；

2015-02-12)

刘芬，100069北京市，首都医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，北京市临床流行病学重点实验室；

E-mail：liufen05@ccmu.edu.cn