14C-尿素呼气试验假阴性原因探讨

14C-尿素呼气试验假阴性原因探讨

高峰1*李文晓1,2

新疆维吾尔自治区人民医院消化科1(830001)石河子大学医学院2

*Email: xjgf@sina.com

14C-尿素呼气试验(14C-urea breath test,14C-UBT)作为一种敏感性、特异性高且安全可靠的非侵入性检测方法，已广泛应用于幽门螺杆菌(Hp)感染的诊断。根据2012年“第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告”中Hp感染的诊断标准，UBT结果阳性即可诊断Hp现症感染[1]，然而假阴性结果的存在将影响诊断准确性，进而影响疾病的治疗。本研究对82例14C-UBT结果为假阴性患者的临床资料行单因素和多因素分析，旨在探讨14C-UBT结果出现假阴性的可能原因，以期提高Hp感染诊断的准确性。

对象与方法

一、研究对象

纳入2014年1月至2014年8月在新疆维吾尔自治区人民医院消化科明确14C-UBT结果为假阴性的患者82例，同期813例14C-UBT结果为真阳性的患者作为对照组。

纳入标准：入组患者均行胃镜活检黏膜组织切片Warthin-Starry(W-S)银染色、14C-UBT 和Hp粪便抗原(HpSA)检测，W-S银染色镜检观察到Hp且HpSA检测结果阳性者判定为Hp感染阳性并纳入研究，其中14C-UBT结果阳性者判定为真阳性，进入对照组，结果阴性者判定为假阴性，进入病例组。

排除标准：①近1个月内使用过抑酸剂、铋剂、抗菌药物、益生菌以及胃复春等中药制剂者；②近3个月内参加过其他药物研究临床试验者；③不能配合完成各项Hp检测者；④因14C-UBT有微量放射性，排除儿童和妊娠、哺乳期女性。

研究方案经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会审核批准，所有入组患者均签署知情同意书。

二、研究方法

1. 胃镜检查和活检黏膜组织切片W-S银染色：入组患者常规行胃镜检查，记录食管、胃、十二指肠黏膜表现和主要病变。常规活检部位为胃窦部大弯侧和小弯侧各1块，如发现病灶，根据实际情况同时于病灶处取活检行病理检查。活检组织4%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，W-S银染色，由2名病理医师分别进行观察，光学显微镜下观察到Hp(黑色或褐色、大多呈弧形、两端微弯的短杆状菌)判定为Hp感染阳性，否则为Hp感染阴性。两名病理医师意见不一致时，由高年资第三方作最终判定。

2.14C-UBT：使用深圳市中核海得威生物科技有限公司提供的尿素[14C]呼气试验药盒(国药准字H20068129)。受检者清晨空腹或禁食、禁水6 h以上后口服14C标记的尿素胶囊，静坐25 min后按药盒说明书要求以集气卡收集气体样品进行液闪测定，检测值≥100 dpm/mmol CO2判定为Hp感染阳性，否则为Hp感染阴性。

3. HpSA检测：使用协和药业有限公司提供的幽门螺杆菌抗原酶联免疫法诊断试剂盒(国药准字S20010093)检测HpSA，严格按试剂盒说明书进行操作。取受检者留取的新鲜粪便样品约100 mg，加入装有400 μL样品稀释液(1∶4稀释)的试管中振荡 30 s，取100 μL加入包被Hp兔抗人多克隆抗体的微孔板，同时设空白孔和阳性、阴性对照孔。每孔加入100 μL HRP标记的Hp抗体轻摇混匀，室温孵育1 h，洗涤6次后拍干，加入100 μL酶底物溶液轻摇15 s，室温孵育15 min，加入100 μL终止液轻摇15 s，10 min 内于酶标仪波长450 nm处测定吸光度(A)值。检测重复2次，结果取均值。A450 nm≥0.161判定为Hp感染阳性，<0.160 为Hp感染阴性。

4. Hp抗体分型：采用免疫印迹法检测血清Hp特异性抗体并据此分型[2]。①Ⅰ型Hp：CagA和(或)VacA抗体阳性；②Ⅱ型Hp：尿素酶抗体阳性，CagA和VacA抗体阴性；③阴性Hp：CagA、VacA、尿素酶抗体均阴性。

5. 合并疾病的诊断：入组患者合并疾病的诊断系综合临床、内镜、活检病理表现和相关检查结果后作出，符合相关共识或临床上通用的诊断标准。

三、统计学分析

结果

一、一般资料

病例组82例患者中男41例，女41例，年龄21~78岁，平均(46.49±12.03)岁；Ⅰ型Hp感染45例，Ⅱ型Hp感染31例，Hp分型抗体阴性6例；合并胃食管反流病(GERD)17例， 慢性非萎缩性胃炎(CNAG)66例，慢性萎缩性胃炎(CAG)10例，胃内胆汁反流14例，胃溃疡(GU)6例，胃息肉12例，胃癌4例，十二指肠炎4例，十二指肠溃疡(DU)13例，十二指肠息肉3例，上消化道出血9例，胃大部切除术史9例。

对照组813例患者中男417例，女396例，年龄20~81岁，平均(44.37±16.29)岁；Ⅰ型Hp感染558例，Ⅱ型Hp感染210例，Hp分型抗体阴性45例；合并GERD 222例，CNAG 642例，CAG 142例，胃内胆汁反流41例，GU 68例，胃息肉102例，胃癌9例，十二指肠炎60例，DU 189例，十二指肠息肉24例，上消化道出血24例，胃大部切除术史12例。

两组间性别和年龄、民族构成差异均无统计学意义(P>0.05)。

二、14C-UBT假阴性结果可能影响因素的单因素分析

单因素分析显示，Hp抗体分型、胃内胆汁反流、胃癌、上消化道出血和胃大部切除术史在病例组与对照组间差异有统计学意义，其余纳入分析的变量均无统计学意义(表1)。对于Hp抗体分型，进一步的χ2分割显示病例组与对照组间Ⅰ型和Ⅱ型Hp感染率差异均有统计学意义，病例组Ⅱ型Hp感染率显著高于对照组(P=0.013, <0.017)，因此Ⅱ型Hp感染进入多因素分析。

表1　14C-UBT假阴性结果影响因素的单因素分析n(%)

三、14C-UBT假阴性结果可能影响因素的多因素分析

对单因素分析显示P<0.1的变量行Logistic逐步回归分析，结果显示胃内胆汁反流、胃大部切除术史、Ⅱ型Hp感染和上消化道出血为14C-UBT假阴性结果的独立危险因素(表2)。

讨论

自1983年Marshall和Warren[3]首次报道从人胃黏膜活检标本中成功分离、培养出Hp以来，Hp感染及其相关疾病一直是消化领域的研究热点，现已明确Hp感染与慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的发生密切相关，世界卫生组织将Hp定义为Ⅰ类致癌原，因此Hp感染的检测和诊断具有重要临床意义。14C-UBT检测Hp感染的原理为：Hp能产生、释放大量尿素酶，将尿素分解为NH3和CO2；口服14C标记的尿素后，如受检者胃内存在Hp，分解产生的14CO2在小肠上端吸收后进入血液循环并随呼气呼出，因此通过分析呼气中的14CO2含量即可判断胃内是否存在Hp。 UBT可反映全胃Hp感染状况，克服了依赖于胃黏膜活检的检测方法因细菌灶性分布而造成的假阴性[1]，准确性高且安全、无创、易于操作，是目前临床上开展最为广泛的Hp感染检测方法，但仍有诸多因素可能影响检测结果的准确性。如国内Hp感染处理共识报告指出，消化性溃疡活动性出血、严重CAG、胃恶性肿瘤可能导致尿素酶依赖性试验结果呈假阴性，胃大部切除术后患者采用UBT检测Hp结果不可靠等[1]。然而，目前临床上往往较重视药物和饮食对14C-UBT结果的影响，而忽略了疾病自身因素的影响。本研究以14C-UBT结果为假阴性的患者为研究对象，对胃黏膜相关因素的影响进行了探讨。

表2　14C-UBT假阴性结果影响因素的多因素分析(Logistic逐步回归分析)

胃黏膜组织切片W-S银染色检测Hp具有直观性，镜检肉眼观察到Hp，诊断Hp感染的可靠性高于14C-UBT；经验证的单克隆抗体法HpSA检测对诊断Hp感染亦有较高的敏感性和特异性[1]。为保证入组患者确为Hp感染者，本研究规定W-S银染色和HpSA检测均为阳性方可判定为Hp感染。结果在895例W-S银染色和HpSA检测均为阳性的患者中，82例(9.2%)14C-UBT结果为阴性(假阴性)，813例(90.8%)14C-UBT结果为阳性(真阳性)。单因素和多因素分析显示，胃内胆汁反流、胃大部切除术史、Ⅱ型Hp感染和上消化道出血为14C-UBT假阴性结果的独立危险因素。

上消化道出血导致14C-UBT结果假阴性的可能原因为：Hp为微需氧菌，环境氧要求为5%~8%，在大气环境和高氧环境中不能生长。体外实验发现，环境pH值上升至4.0~5.0时，尿素酶活性进行性降低[4]。消化道出血时，胃内血液一方面可中和胃酸，提高胃内pH值，另一方面可释放大量氧气抑制Hp生长，导致14C-UBT有较高的假阴性率。林勇等[4]的研究证实，在消化性溃疡合并出血患者中，14C-UBT的假阴性率高达62.5%。李舜等[5]评估了14C-UBT在不同胃十二指肠黏膜病变中的诊断价值，亦发现其在合并上消化道出血者中假阴性率最高(38.7%)。

胆汁反流至胃腔可破坏胃黏膜屏障，使胃腔内的H+逆向弥散至黏膜，破坏黏膜下环境，不利于Hp生长；同时胆酸对Hp具有强烈抑制作用，在高浓度胆汁酸的作用下，Hp外形浓缩成团块状而失去活性[6]。Hp生长受抑导致胃内Hp密度降低，可能造成胃内胆汁反流患者14C-UBT假阴性率增高。

胃大部切除术后患者胃内Hp密度降低，同时残胃的排空速度加快[5,7]，使14C标记的尿素在胃内停留的时间变短，难以与胃黏膜充分接触，从而影响呼气中的14CO2含量，导致14C-UBT假阴性率增高。此外，胃大部切除术后胃空肠吻合(Billroth Ⅱ式)所致的胃内胆汁反流以及残胃胃酸缺乏、pH值升高，可能亦为14C-UBT假阴性率增高的原因之一。李晓波等[7]评估了各种常用Hp感染检测方法在胃大部切除术后患者中的诊断价值，发现14C-UBT的特异性为100%，敏感性仅为63.6%，表明其不适用于此类患者Hp感染的诊断。李舜等[5]的研究中，14C-UBT 在胃大部切除术后患者中的假阴性率为27.3%，仅次于合并上消化道出血者。

除胃黏膜相关因素外，本研究发现14C-UBT假阴性结果的产生尚与所感染Hp菌株的类型有关，病例组Ⅱ型Hp感染率显著高于对照组(37.8%对25.8%)，表明Ⅱ型Hp感染较Ⅰ型Hp感染更易导致14C-UBT假阴性结果。Ⅱ型Hp尿素酶阳性但不表达毒力因子CagA和VacA，菌株毒力较小，其易导致14C-UBT假阴性结果是否与菌株毒力有关，亦或尚有其他因素参与，有待进一步研究探讨。

综上所述，胃内胆汁反流、上消化道出血、胃大部切除术史和Ⅱ型Hp感染是14C-UBT假阴性结果的可能影响因素。临床上应重视胃黏膜病变本身对14C-UBT结果的影响。对于有胃大部切除术史者以及合并胃内胆汁反流、上消化道出血者，如14C-UBT结果为阴性，建议采取胃黏膜组织切片染色镜检、快速尿素酶试验、HpSA检测等多种方法联合检测Hp，以提高诊断准确性。

参考文献

1 中华医学会消化病学分会幽门螺杆菌学组/全国幽门螺杆菌研究协作组；刘文忠，谢勇，成虹，等. 第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告[J]. 胃肠病学, 2012, 17 (10): 618-625.

2 季新明，吕再玉. 幽门螺杆菌分型检测90例临床分析[J]. 浙江临床医学, 2008, 10 (1): 83.

3 Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration[J]. Lancet, 1984, 1 (8390): 1311-1315.

4 林勇，李荣洲，郑超秀，等.14C-尿素呼气试验在消化性溃疡并出血病人假阴性原因分析[J].浙江临床医学, 2004, 6 (7): 577.

5 李舜，张家云，邓咏梅.14C-尿素呼气试验在不同胃黏膜病变中的诊断价值及影响因素分析[J]. 实用医学杂志, 2005, 21 (5): 477-478.

6 王伯军. 胆汁反流性胃炎的病因分析及与幽门螺杆菌关系[J]. 中华消化杂志, 2004, 24 (5): 298-299.

7 李晓波，刘文忠，戈之铮，等. 胃大部切除术后患者幽门螺杆菌感染诊断方法的评估[J].中华消化杂志, 2002, 22 (10): 608-610.

(2014-11-05收稿；2014-11-23修回)

背景：14C-尿素呼气试验(14C-UBT)敏感性、特异性高且为非侵入性，已广泛应用于幽门螺杆菌(Hp)感染的诊断，然而假阴性结果的存在将影响诊断准确性。目的：探讨14C-UBT结果出现假阴性的可能原因，以期提高诊断准确性。方法：纳入2014年1月至2014年8月在新疆维吾尔自治区人民医院明确14C-UBT结果为假阴性的患者82例，同期813例14C-UBT结果为真阳性的患者作为对照组。两组患者均经Warthin-Starry银染色和Hp粪便抗原检测判定为Hp感染阳性。以单因素和多因素分析筛选可能与14C-UBT假阴性结果相关的因素。结果：单因素分析中，共5个变量在病例组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)，进入多因素分析。Logistic逐步回归分析显示，胃内胆汁反流(OR=3.961,P<0.001)、胃大部切除术史(OR=9.734,P<0.001)、Ⅱ型Hp感染(OR=1.892,P=0.012)和上消化道出血(OR=4.979,P<0.001)为14C-UBT假阴性结果的独立危险因素。结论：胃内胆汁反流、上消化道出血、胃大部切除术史和Ⅱ型Hp感染是14C-UBT假阴性结果的可能影响因素。对于有胃大部切除术史者以及合并胃内胆汁反流、上消化道出血者，如14C-UBT结果为阴性，建议采取多种方法联合检测Hp。

关键词14C-尿素呼气试验；假阴性反应；幽门螺杆菌；诊断

Investigation on Causes of False-negative14C-Urea Breath TestGAOFeng1,LIWenxiao1,2.1DepartmentofGastroenterology,thePeople’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi(830001);2ShiheziUniversitySchoolofMedicine,Shihezi,XinjiangUygurAutonomousRegion

Background:14C-urea breath test (14C-UBT) is widely used for diagnosis ofHelicobacterpylori(Hp) infection owing to its noninvasiveness and high sensitivity and specificity. Nevertheless, the presence of false-negative result can influence the diagnostic accuracy. Aims: To investigate the possible causes of false-negative14C-UBT for improving the accuracy of diagnosis. Methods: Eight-two cases with confirmed false-negative14C-UBT and 813 controls with true-positive14C-UBT at the People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region from Jan. 2014 to Aug. 2014 were enrolled. Patients in both groups were diagnosed as positive for Hp infection by Warthin-Starry silver staining combined with Hp stool antigen test. Univariate and multivariate analysis were performed to screen the factors related with false-negative14C-UBT. Results: In univariate analysis, 5 variables were significantly different between case group and control group (P<0.05), and were taken into the multivariate analysis. Logistic stepwise regression analysis revealed that bile reflux (OR=3.961,P<0.001), post subtotal gastrectomy (OR=9.734,P<0.001), type Ⅱ Hp infection (OR=1.892,P=0.012) and upper gastrointestinal bleeding (OR=4.979,P<0.001) were the independent risk factors for false-negative14C-UBT. Conclusions: Bile reflux, upper gastrointestinal bleeding, post subtotal gastrectomy and type Ⅱ Hp infection might be the influential factors for false-negative14C-UBT. Combined tests for Hp infection should be suggested in patients with negative14C-UBT who had undergone subtotal gastrectomy or complicated with bile reflux or upper gastrointestinal bleeding.

Key words14C-Urea Breath Test;False Negative Reaction;Helicobacter pylori;Diagnosis

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.03.006