实验性自身免疫性重症肌无力动物模型研究

实验性自身免疫性重症肌无力动物模型研究

王银萍1，陈静2，林海娇1，衣春光3，王健1*

(1.长春中医药大学附属医院,长春 130021;2.长春市中医院,长春 130022;

3.长春中医药大学,长春 130117)

摘要：研究表明，实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)与重症肌无力(MG)在症状、病理、免疫及组织学方面相似。EAMG动物模型主要通过主动或被动免疫实验动物，制备与重症肌无力患者的临床表现、免疫组织学、电生理学等相似的动物模型，为临床诊断及治疗提供依据。但目前EAMG模型仍不完善，仍需进一步探索。

关键词：自身免疫性重症肌无力；实验模型；实验研究

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.068

中图分类号：R285.5文献标志码：A

文章编号：2095-6258(2015)06-1282-04

基金项目：吉林省教育厅科技发展计划项目(吉教科合字[2011第58号]);吉林省教育厅科技发展计划项目(吉教科合字[2012第62号]);吉林省教育厅“十一五”规划项目(吉教科合字[2010第54号])；吉林省科技厅中药办项目(20110933)。

作者简介：王银萍(1984-)，主治医师，主要从事中医内科研究。

收稿日期:(2015-09-20)

*通信作者：王健，主任医师，电话-15948000772，电子信箱-jian-wang222@163.com

Experimental autoimmune myasthenia gravis animal models

WANG Yinping1，CHEN Jing2，LIN Haijiao1，YI Chunguang3，WANG Jian1*

(1.Affiliated hospital of Changchun university of Chinese medicine, Changchun 130021, China;

2. Changchun Chinese medicine hospital, Changchun 130022, China;

3. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Abstract：Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis, EAMG) animal model mainly through active or passive immunization of Experimental animals, the preparation and clinical manifestation of patients with Myasthenia Gravis, immune histology, electrophysiology and other similar animal models, which provide the basis for clinical diagnosis and treatment. But currently EAMG model is still not perfect, still need to be solved.

Keywords：EAMG；experimental model；experimental research

重症肌无力(MG)是一种神经-肌肉接头处传递障碍的获得性自身免疫性疾病。据统计，本病的发病率为8～20/10万[1]，且近年来发病率呈逐年上升趋势，以老年人为著[2]。为进一步研究本病的发病机制及治疗方法，动物实验越来越被关注[3-5]。笔者现将近几年有关本病的动物实验模型制备作一阐述。

1EAMG的免疫方式

1.1主动免疫法1.1.1以AchR蛋白为免疫原目前最为经典的造模方法[6]主要是从丁(氏)双鳍电鳐的电器官分离乙酰胆碱受体(AchR)，通过Folin酚试剂法及酶联免疫吸附法(ELISA)检测提取AchR的含量及活性；以提取的AchR与完全福氏佐剂(CFA)充分混合,分别于实验大鼠的足垫、腹部及背部皮下多点注射乳剂1.5 mL，第4周再次注射上述乳剂免疫大鼠。CFA对照组只接受等量CFA皮下注射 。此种造模方法是目前最为经典、成模率最高的一种实验方法，延续至今，目前仍有学者应用这一造模方法[7]。但是在实际中却难以操作，原因是由于双鳍电鳐本身稀有，难以捕获，并且从中提取AchR过程复杂，因此在实际实验中存在着一定的困难，难以推广使用。1.1.2以人工合成的AChR-α亚基多肽为免疫原AChR是由2个α、1个β和1个γ亚基组成，3个亚基各有其生理功能，但α亚基是引起MG的抗原决定簇。随着科学技术的迅速发展，目前市场上已经存在多种人工合成的AchR的α亚基多肽，电鳐中提取AchR的α亚基多肽代价太高，人工多肽逐渐被医学界接受。目前使用最多的人工多肽[8]：鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段、α138-167肽段、α125-147肽段、α129-145肽段、α1-210肽段等，其免疫过程与徐浩鹏等[6]实验方法基本一致。近10年的实验研究主要侧重此实验试剂及方法，而近5年的实验研究更少。但从文献报道中显示，每个实验的动物模型例数较少，大多30只左右，缺少大批量的实验动物。笔者通过多次实验研究，分别采用人工鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段、α129-145肽段进行免疫Lewis大鼠，实验过程严格按照徐浩鹏等[6]实验方法操作,但最终成模率不足30%,显示人工合成的AchR的α亚基多肽诱导EAMG成功率并不理想。最新文献报道[9]，使用AchR(m97-116)肽段-CD205融合单链抗体进行免疫C57雌性小鼠共2只，成模率100%，但数量减少，有待于进一步实验证明。1.2被动免疫法1.2.1采用MG患者血清中AchR抗体MG被动免疫小鼠模型的制备，采用未进行手术或未使用激素及免疫抑制剂治疗的阳性血清患者(SPMG)，正常人的血清为阴性血清(SNMG)，每日分别在小鼠腹腔内注射SNMG或SPMG患者血清0.6 mL，连续7 d。所有小鼠在注射血清后24 h腹腔注射环磷酰胺(30 mg/kg)以抑制免疫反应[10]。 SCHONBECK等[11]通过胸腺移植建立EAMG，通过移植MG患者的胸腺组织至严重免疫缺陷小鼠肾被膜下1~2周后，在实验小鼠血清中可检测到抗人AchR-Ab，11周时抗人AchR-Ab滴度可升高至重度MG水平。实验结果表明，MG患者的胸腺组织可以诱导EAMG。由于MG患者血清中存在各种异常的免疫蛋白及炎症介质，所以在模型制备过程中是否存在干扰，目前无人研究，故此种造模方法尚不能被多数医家接受。1.2.2 采用乙酰胆碱受体单克隆抗体建立动物模型此实验方法选择的主要抗体是乙酰胆碱受体(nAchR)单克隆抗体mAb35，主要是通过mAb35注射C57BL/6幼年小鼠腹腔内进行免疫。具体实验方案：健康清洁级雌性C57BL/6小鼠48只，4～5周龄，体质量12～14 g,参照文献[12]将实验动物分为实验组(E)和对照组(N)，实验组分为3组(El、E2、E3)，每组12只。分别经腹腔注射含0.5、1.0、1.5 mg/kg mAb35的Ringer’s液0.2 mL给B6幼年小鼠，对照组(N)注射不含mAb35的Ringer’s液0.2 mL[13]，3 d后各组小鼠出现不同程度的肌无力表现，重者可导致呼吸肌无力而死亡 。虽然该实验方法成模率较高，成模速度快，但临床症状消失也快，不符合人类的患病特点，故该实验方法难以被广泛应用。1.2.3基因疫苗免疫小鼠建立重症肌无力动物模型郝志波等[12]用基因疫苗pcDNA2AchRɑ211免疫C57BL/6小鼠建立 EAMG。方法是将人乙酰胆碱受体α亚基N端的主要免疫区(AChRa 211)的基因片段插入到穿梭载体pcDNA3．0中，构建基因疫苗pcD-NA2AChRɑ211。大量提纯质粒pcDNA2AChRɑ211后肌肉注射C57BL/6小鼠。用ELISA法检测小鼠血清中抗AChRa 211的AChR-Ab，并用PCR方法检测外源基因在小鼠各组织器官中的分布情况。该实验方法成功率较高，表现较好，但由于该实验中需要从MG患者中提取AChRa 211基因片段，过程复杂，要求科技水平较高，实际操作中存在着一定的困难。

2模型成功标准

2.1临床症状首先可以通过测量实验动物的体质量来评估，即实验前及接种后每2周称重1次。另外可以通过测量肌力来评估，对于轻度肌无力者可通过疲劳试验来评估，连续让实验动物重复抓握笼顶30 s再测量。分级方法可采用Lennon进行评分，0级:没有肯定的肌无力表现；1级:撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少，且容易疲劳；2级：明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背、抓握力弱；3级：在抓握前即有严重的肌无力表现、无力抓握、濒死状态；4级：死亡。2.2新斯的明试验法[14]予新斯的明(37.5 μg/kg)和硫酸阿托品(15 μg/kg)分别于大鼠腹腔注射,12 min后成功模型组大鼠可表现为无力症状明显好转，但一般可持续2～12 h。2.3低频重复电刺激检查电衰减反应阳性[15]将麻醉后的小鼠仰卧固定在解剖板上，将其下肢解剖，分离出腓肠肌及跟腱，然后将肌电图的电极一根插入腓肠肌内侧头,另一根插入跟腱皮下,给予3~5 HZ、连续10次的低频电刺激,成功实验模型经刺激后肌电图应呈现为腓肠肌电位及收缩波幅呈衰减波形。2.4测定血清中AchR-ab的含量通过眼球取血法，将血离心分离血清，分装后-80 ℃保存待测，采用ELISA法检测，操作严格按照试剂盒说明书进行，在酶标仪上波长为450 nm处测定A值，根据标准曲线，读出抗体水平。2.5AChR数目的计算将正常组及模型组大鼠腓肠肌溶于l%(体积分数)Triton X-100 中，分别加入过量125Ⅰ标记α-银环蛇毒的磷酸盐缓冲液，孵育1～3 h后加入过量兔抗鼠 IgG，所得沉淀物用磷酸盐缓冲液冲洗2遍，用γ-计数仪计数，再用标准曲线求取已结合抗体的 AChR数。成功的重症肌无力模型大鼠肌肉中的AChR数目与正常大鼠比较明显减少[16]。2.6光镜将实验动物处死，迅速取出腓肠肌，使用多聚甲醛固定，石蜡包埋，辣根氧化酶孵育切片1 h，用磷酸盐缓冲液反复冲洗3次，再用联苯二胺双氧水在室温下显色，最后在光镜下观察运动终板上AChR数目的改变。成功模型组光镜下可见到EAMG动物神经末梢和肌纤维处有巨噬细胞浸润，部分肌细胞呈节段性坏死，运动终板上AchR数目减少 。2.7电镜与光镜不同的是电镜使用高碘酸盐2赖氨酸 2多聚甲醛(PLP)液固定2 h后沿肌纤维走行切成 0.15 cm×0.15 cm×1.1 cm大小块，用PBS冲洗后再放入辣根氧化酶中，于4 ℃孵育2 h，再用 PBS洗净，以联苯二胺双氧水显色。最后在立体显微镜下寻找神经肌肉接头的部位，使用戊二醛及锇酸固定、脱水、环氧类树脂包埋、切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后使用电镜观察。电镜下显示[17]成功模型组模型突触后膜皱褶退化，突触间隙加宽。

3小结

重症肌无力属于世界疑难性疾病，发病率较高，但治疗局限，仅限于激素、免疫抑制剂、血浆置换，疗效不尽人意，最终给家庭及社会带来沉重负担。中医药治疗本病疗效显著，但其作用靶点仍缺乏大量动物实验学证据。研究表明,EAMG与MG在症状、病理、免疫及组织学方面相似，因此越来越多的实验研究逐渐被重视。经典的动物实验模型是自然提取电鳐中AchR蛋白进行免疫Lewis大鼠,成模率较高，但其制备过程难度高，且电鳐稀有，费用昂贵，因此该实验方法难以推广应用；人工合成的AchR蛋白倍受医学界欢迎，但通过搜索资料及实验研究表明，应用人工合成的AchR蛋白进行免疫的实验方法仍较多，但缺少大量成功模型的研究，并且有关EAMG的实验方法越来越少。因此，成功制备EAMG模型仍是医学工作者亟待解决的问题。

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