产α－半乳糖苷酶菌株的筛选、酶学特性和固定化研究

赵晴潇，魏 群

(东北电力大学化学工程学院，吉林吉林132012)

α－半乳糖苷酶也称蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，加水可以分解蜜二糖［1］。α－半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物中，不同来源的α－半乳糖苷酶其理化特性相差明显。以植物(咖啡、车前草、蚕豆、西瓜)取材的α－半乳糖苷酶研究得较多。在各种哺乳动物组织匀浆中也存在α－半乳糖苷酶，以人和鼠的甲状腺、肾脏和脾脏的酶活最高。微生物来源的α－半乳糖苷酶研究的也比较深入。特别是丝状真菌α－半乳糖苷酶由于其合适的pH、良好的稳定性、细胞外分泌和表达量较高的特点而成为研究的热点。但当前国内外学者对于不同来源α－半乳糖苷酶的研究发现，无论是从动植物、微生物或者采用其它技术手段获得的α－半乳糖苷酶均存在着如下两个问题:一是该酶的提取工艺复杂，耗费大量生产成本，为该酶在工业上大量应用的一个弊端;二是普遍酶活性不高，固定化后活力进一步下降，导致重复使用的困难，不能满足工业化生产中特殊要求［2－5］。本实验试图筛选一株具有高酶活的产α－半乳糖苷酶菌株并对其固定化研究，以求解决这一问题。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

泡菜汁(市售)、对硝基苯α－D－半乳糖苷和对硝基酚、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X－α－Gal)、棉子糖。

1.1.2 主要仪器

离心机、恒温培养箱、摇床、数显恒温水浴锅、灭菌锅、紫外诱变箱、循环水多用真空泵。

1.1.3 培养基

初筛培养基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、磷酸二氢钾2 g、柠檬酸二胺2 g、乙酸钠5 g、葡萄糖20 g、七水硫酸镁0.58 g、四水硫酸锰0.25 g、吐温800 mL，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。1 mL X－α－Gal/L溶液(每800毫升添加50毫克指示剂)。

发酵培养基:初筛培养基中2%的葡萄糖用棉子糖取代。

1.2 分析方法

1.2.1 产α－半乳糖苷酶菌株的筛选

(1)初筛

在无菌条件下，用无菌双蒸水对泡菜汁进行逐级梯度稀释(10－1－10－7)，吸取 10－5、10－6及 10－7三个梯度各100 μL溶液分别涂布在初筛固体培养基上，37℃下培养3－4 d，使菌落变成蓝色的菌落，挑取单菌落进行液体发酵。

(2)发酵

将初筛的菌种接种于发酵培养基中，用对硝基酚法测定酶活，筛选出酶活力最大的菌株作为目标菌株［5］。

(3)紫外线诱变

将制备好的菌悬液放置在紫外诱变箱中，利用15W紫外灯，照射距离25 cm，设置照射时间分别为0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min、3 min 6 个梯度处理。

(4)亚硝酸钠诱变

将制备好的菌悬液用亚硝酸钠及醋酸分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，加入 pH 8.6的Na2HPO4溶液终止反应。以亚硝酸钠处理6 min的菌株A为实验菌种，在斜面上连续传代5代。

1.2.2 对硝基酚法测α－半乳糖苷酶酶活力

利用对硝基酚法测α－半乳糖苷酶酶活力［6］。

1.2.3 酶学性质研究

(1)α－半乳糖苷酶的最适pH

将α－半乳糖苷酶液在pH4.5－pH7.5下进行酶促反应以测定其最适pH值。以pNPG为底物，37℃下反应15 min测定酶活［7］。

(2)α－半乳糖苷酶的最适温度

将α－半乳糖苷酶液在35℃－65℃下进行酶促反应以测定其最适温度，以pNPG为底物，pH5.5反应15 min测定酶活。

(3)热稳定性

以pNPG为底物，pH5.5，温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的条件下保温1 h，测定保温后的残余酶活性［8］。

(4)金属离子对α－半乳糖苷酶活力的影响

用浓度为0.01 mol/l的金属离子Ca2+、K+、Fe3+、Cu2+、EDTA分别与酶液以1:1的比例进行混合，37℃保存1 h后，分别在最适条件下进行酶活的测定。以未处理的酶液的酶活为100%计。

1.2.4 α－半乳糖苷酶固定化

配制不同浓度(1%、2%、3%、4%、5%)的海藻酸钠，各取5 mL放于不同的烧杯中，各加入5 mL菌悬液，混匀静置30 min，用7号注射器吸取1 mL混合液逐滴滴入20 mL 2%的CaCl2溶液中，室温固定0.5 h。

2 结果与讨论

2.1 高产α－半乳糖苷酶菌株的筛选

2.1.1 菌种的定向筛选

吸取10－5、10－6及10－7三个梯度稀释的泡菜汁涂布于初筛固体培养基上，37℃下培养3－4 d后，菌落显示蓝色的有9株，进一步通过发酵培养后测定酶活。酶活力最强菌株酶活可达19.7 U/mL，本研究以此菌株作为出发菌株。此菌株在固体培养基上生长48 h后，形成乳白色圆形菌落，且表面光滑、边缘整齐、无褶皱、呈短杆状、直径约1 mm、革兰氏染色阳性。

2.1.2 紫外诱变选育

将制备好的菌悬液放置在紫外诱变箱中，诱变 0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min、3 min，紫外诱变对致死率的影响结果如表1所示。根据菌种诱变致死率与基因突变率的一般规律，致死率在80%时的正突变率较高，确定照射时间为2.0 min为最佳处理时间。将照射时间为2.0 min的菌株进行发酵培养，取发酵培养液测酶活，结果显示酶活达28.6 U/mL，酶活提高45%。

表1 紫外线诱变处理结果

2.1.3 亚硝酸钠诱变

将制备好的菌悬液用亚硝酸钠与醋酸的混合液分别处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min，加入pH 8.6的Na2HPO4溶液终止反应。处理时间对致死率的影响结果如表2所示。根据菌种诱变致死率与基因突变的一般规律，致死率在80%时的正突变率较高，确定处理时间为6 min为最佳处理时间，酶活达36.9 U/mL酶活相比出发菌株提高87%。

表2 亚硝酸钠诱变处理结果

2.1.4 传代性能

传代后测定酶活力结果如表3所示，经多次传代，该菌株产α－半乳糖苷酶活性没有多大变化，均保持在95%左右。表明该突变菌株具有较好的遗传稳定性，可作为工业化大生产的种子使用。

表3 传代稳定性

2.2 α－半乳糖苷酶酶学性质研究

2.2.1 α－半乳糖苷酶的最适pH和温度

以pNPG为底物，反应温度37℃，pH为4.5－7.5，设pH间隔为0.5的不同pH缓冲液，反应时间15 min，测定酶活。所测得的最高酶活为基准酶活100%，其余数据折算，以比较不同的pH缓冲液对相同酶液的酶活影响。结果如图1所示，菌株液体发酵产生的α－半乳糖苷酶在pH5.5左右表现出较高的酶活力。说明该酶最适pH偏酸，适合应用于酸性环境下的工业化生产。

图1 pH对α－半乳糖苷酶活力的影响

以pNPG为底物，反应pH5.5，35℃－65℃，设间隔温度5℃，反应时间15 min，测定酶活。所测得的最高酶活为基准酶活100%，其余数据折算，以比较不同的温度对相同酶液的酶活影响。结果如图2所示，酶活力随温度升高而增大，测得最适反应温度，超过此温度，酶活力便急剧下降。菌株所产α－半乳糖苷酶的最适作用温度为50℃，当温度超过50℃酶活力下降较快。

2.2.2 α－半乳糖苷酶的热稳定性

以pNPG为底物，pH5.5，温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的条件下保温1 h，测定保温后的残余酶活性，结果如图3所示。酶活力在30℃、40℃和50℃时都比较稳定，保持为90%以上;在60℃时酶活力保留在35%左右，70℃时酶活仅保留了约5%;而80℃保温1.0 h酶活就已降到0%，完全失活。说明α－半乳糖苷酶在50度以下比较稳定，50℃以上酶活逐渐丧失，实际应用中应尽量将其存放在50℃以下环境，保证其最大酶活力的发挥。

图2 温度对α－半乳糖苷酶活力的影响

2.3 α－半乳糖苷酶的固定化初步探索

将1%－6%海藻酸钠溶液与酶液按1∶1比例混合，吸入注射器内，再逐滴滴入2%氯化钙和卡拉胶混合溶液中，即成规则球形，0.5 h后，测定酶的活力。结果如图4所示，海藻酸钠固定化后，酶活有不同程度损失，海藻酸钠浓度为4%时酶活力较高，可以保持在70%左右［9］。因此可用4%海藻酸钠固定α－半乳糖苷酶。

图3 α－半乳糖苷酶的热稳定性图

图4 海藻酸钠浓度对固定化酶酶活的影响

3 结 论

本实验以泡菜汁为原料筛选产α－半乳糖苷酶菌株，通过X－α－Gal平板显色初筛，获得9株产α－半乳糖苷酶的菌株。其中酶活力最强菌株酶活达19.7 U/mL。以该菌株为出发菌株，分别通过紫外线诱变和亚硝酸钠诱变处理，使诱变菌株酶活达到36.9 U/mL。对高酶活菌株进行5次传代培养，诱变后的菌株的高酶活性能未发生很大变化，表明其具有良好的遗传稳定型。接着研究了复筛得到的α－半乳糖苷酶酶学性质，此酶的最适反应温度为50℃，最适pH为5.5。初步探索该酶的固定化结果表明海藻酸钠固定化α－半乳糖苷酶的最佳浓度条件为:以4%的海藻酸钠与稀释酶液1∶1(V∶V)混合时固定化酶的酶活较高。一种固定化酶能否应用于工业生产，关键在于固定化方法要简单易行、固定化后酶的活性要高、操作半衰期要长、固定化费用要低。本试验用海藻酸钠固定化α－半乳糖苷酶的方法虽然简单易行、固定化费用较低、所得固定化酶的酶活较高，但机械强度较差。凝胶强度不够而导致易破碎溶解且海藻酸钙凝胶不耐热，高温下加速溶解，因此仍有待进一步研究。成品化的α－半乳糖苷酶有望于解决特殊人群对豆类食品的消化障碍，提高豆粕在饲料中的利用率，提高蔗糖的析出率，增加包埋药物的稳定性，延长药效［10－13］。

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