当药苦苷体内向香豆素类化合物转化过程的研究

★　李胜　(鹰潭市人民医院药剂科　江西 鹰潭335000)

当药苦苷体内向香豆素类化合物转化过程的研究

★李胜(鹰潭市人民医院药剂科江西 鹰潭335000)

摘要：目的：探究当药苦苷体内向香豆素类化合物转化的过程。方法：通过设计化学衍生化-LC/MS的方法对可能代谢物进行检测，当药苦苷的体外主要的代谢产物为红百金花内酯，于是采用衍生化的方法提高其检测灵敏度。再经过动物实验和肝微粒孵育进行验证。结果：样品处理后经LC/MS经色谱测定后，专属性、精密度和准确度、稳定性等均满足生物样品分析，大鼠血浆中ECR定量分析，平均最高血药浓度、最长吸收时间、最大药时曲线面积分别为425.8±127.6ng/mL,128.6min,38.8μg/mL·min。结论：大鼠灌胃当药苦苷后血浆经衍生化，成功在血浆中检测到了红百金花内酯，当药苦苷首先在体内被水解变成苷元，大部分苷元经重排变成红百金花内酯，一个二氢香豆素，首次阐明了当药苦苷的大鼠体内代谢产物，发现其可以由单萜类化合物转化为生物碱类和香豆素类化合物，并以代谢物的形式发挥药效。丰富了环烯醚萜类化合物的体内代谢研究方法。

关键词：当药苦苷；香豆素；化学衍生化

当药苦苷是獐芽菜属植物中分布最广、含量最高的裂环烯醚萜氧糖苷类成分之一。相关研究[1-2]表明当药苦苷具有清肝利胆、解痉镇痛、降低血脂和消炎抑菌等药理作用，由于其具有较强的生物活性且拥有丰富的资源，具备深入研究开发的潜力，主要转化产物是红百金花内酯，为探索该代谢物的存在，本文采用衍生化-LC/MS的方法进行观察，并通过动物实验和肝微粒孵育进行验证。

1材料

1.1试药当药苦苷(纯度>98%)、红百金花内酯(纯度>98%)。DNPH(2,4-二硝基苯肼)，内标MFB(4-甲酰苯甲酸甲酯)购于sigma 公司。色谱级乙腈购于德国Merck公司。色谱甲醇购自美国Fisher公司。去离子水购自广州屈臣氏。Wistar 大鼠(250±10)g(黑龙江中医药大学动物实验中心)。

1.2仪器Agilent 1200超高效液相色谱(美国Agilent公司);色谱柱采用Hypersil GOLD C18 色谱柱(50mm×2.1mm 粒径1.9μm)(Thermo Fisher Scientific,Waltham ,MA);柱温30℃;进样量为5ΜL;流动相A为1%甲酸和水，流动相B为1%甲酸和乙腈，流速0.4mL/min 。洗脱程序如下：0min 20%B, 2.5 min, 40% B; 4 min, 99% B；5 min 20% B,最后平衡1min，总时间为6min.质谱检测条件：Agilent 6520质谱(美国安捷伦公司),毛细管电压4000V，裂解电压100V， 喷雾压力 45 psi，干燥气体(N2)流速9L/min， 干燥气体温度330℃，检测范围100-1000Da.检测离子:伯醇衍生物m/z 355.0684[M+H]+,内标物衍生物m/z 343.0684[M+H]+。

2方法和结果

2.1样品处理在进行大鼠血浆中红百金花内酯衍生化-LC/MS方法的建立与大鼠灌胃给药后，(1)红百金花内酯体外衍生化过程，分别向500μL 2.273mmol/L ECR 乙腈溶液，和500μL 1.22 mmol/L MFBC 乙腈溶液。混合后的溶液37℃放置1h。3mL乙酸乙酯：正己烷(1:5)加入到混合溶液中，涡旋，室温静置分层。上层溶液25℃ N2吹干，残渣500μL甲醇复溶，LC-ESI-MS分析。(2)给药后的大鼠血浆样品衍生化200mg/kg当药苦苷水溶液灌胃给大鼠,0.17,0.33,0.5,1,2,4,6,8,10,12,24,36 和48h采血。200μL血浆中加入600μL乙腈，涡旋30s，4℃ 12000rpm离心10min，留上层溶液。取500μL上清液加入到EP管中，进行衍生化。方法同红百金花内酯体外衍生化。(3)标准溶液的配置精密称取一定量的ECR,MFBC(IS)用乙腈溶解，并各自稀释成1mg/mL和10mg/mL的工作液。4℃环境保存。(4)标准曲线的制备内标液1μg/mL由稀释原始工作液得来。取空白大鼠血浆90μL于1.5mL塑料离心管中，依次加入不同浓度的ECR标准溶液10μL，内标标准液10μL,配置成药物浓度范围在0.5-500ng/mL(1, 25, 250ng/mL)的标准溶液。记为高浓度、中浓度、低浓度QC。

2.2法学考察

2.2.1精密度试验取空白物质基质，按照标准曲线项下的方法，分别在同一批内和不同批间制备含红百金花内酯浓度为(1,25,250ng/mL)的质控样品，并分析测定。

日内精密度：在一个工作日内完成，要求随行制备一条标准曲线和每一浓度制备5个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度的变异系数。

2.2.2日间精密度在3个共日内完成，每个工作日完成一个分析批的样品测定，要求每一分析批内制备一条标准曲线，每个浓度一个样品，每个样品测定一次。用随行标准曲线分别计算3个浓度的变异系数。

2.2.3回收率试验取空白物质基质，分别制备含红百金花内酯浓度为1，25,250ng/mL的质控样品，按照标准曲线项下的方法处理并分析测定，与用流动相所制备的相同浓度样品衍生化处理比较所得。

2.2.4衍生化过程大鼠灌胃当药苦苷后血浆经衍生化，成功在血浆中检测到了红百金花内酯,见图1，对大鼠灌胃后的体内红百金花内酯进行检测，色谱图见图2.

图1　当药苦苷体内代谢成红百金花内酯及其衍生化过程

图2　血浆中红白金花内酯色谱检测

-one 。

2.2.5专属性样品处理后经LC/MS经测定在上述色谱系统中，血浆中的内源物质及其他杂质不干扰样品的测定。各检测物色谱行为较佳，红百金花内酯和4-甲氧基苯甲酸甲酯衍生物的保留时间分别为4.6min和5.1min。

2.2.6精密度和准确度本方法中高、中、低三个浓度日内和日间精密度分别<8.13,<6.19,准确度在0.86%-5.13%之内。回收率62.2%-70.8%。满足生物样品分析的要求,见表1 。

2.2.7稳定性考察不同实验条件下，测定室温放置一段时间后的大鼠血浆中红百金花内酯的浓度，以及-20℃放置3天后伯醇衍生产物的稳定性，结果如表2。在进样瓶中放置16h，-20℃放置3天，溶液浓度无明显变化,说明稳定性良好。

表1红百金花内酯衍生物在大鼠血浆中的日内精密度和日间精密度

样品浓度/ng·mL-1日内(n=5)CV/%RE/%日间(n=15)CV/%RE/%11.06±0.074.514.581.09±0.105.964.662525.59±0.773.362.6126.21±0.734.522.55250261.28±71.237.534.20261.52±56.245.303.54

表2　红百金花内酯和其衍生物的稳定性

2.2.8大血浆中ECR定量分析二硝基苯肼衍生化成功用于红百金花内酯血药浓度的测定。大鼠灌胃给药当药苦苷水溶液200mg/kg后，根据药时曲线平均最高血药浓度，最长吸收时间，最大药时曲线面积分别为425.8±127.6ng/mL,128.6min ,38.8μg/mL·min。

3讨论

当药苦苷大鼠灌胃后，血浆用羰基试剂处理，得到了与羰基试剂结合的红白金花内酯衍生物。推断可能是红白金花内酯与血中白蛋白发生共价结合[3]，羰基试剂把其置换，产生的衍生化产物具有很高的质谱检测灵敏度，于是被检测到。以上对新代谢物的合成，从化学角度对其结构进行了准确无误的确认，也为其活性测试做好了物质准备，当药苦苷首先在体内被水解变成苷元，大部分苷元经重排变成红百金花内酯，一个二氢香豆素，红百金花内酯在肝脏中被进一步代谢成终产物3,4-dihydro-5-(hydroxymethyl) isochroman-1-one的硫酸结合物，并被排出体外。即环烯醚萜化合物当药苦苷在体内最终被代谢成含氮化合物及香豆素。本研究对当药苦苷的体内代谢过程进行了研究,阐明了当药苦苷的大鼠体内代谢产物，发现其可以由单萜类化合物转化为生物碱类和香豆素类化合物，并以代谢物的形式发挥药效。

参考文献

[1]李林虎,陈莉,夏玉凤. 抗肿瘤香豆素类化合物的研究进展[J].中国药科大学学报,2013,44(4):374-379.

[2]夏令先,王玉斌,黄文龙,等. 香豆素类化合物的抗肿瘤作用研究进展[J].中国新药杂志,2013,22(20):2392-2404.

[3]步达,姚晓,郑紫婷,等. HPLC法测定明党参组织培养物和栽培品中香豆素成分的含量[J].天然产物研究与开发,2014,26(10):1638-1643.

Study on the Transformation Process of Swertiamain in Medicine to Coumarins

LI Sheng

People'sHospitalofYingtan,PharmacyDepartment，Yingtan335000,China.

Abstract:Objective: To explore the process of medicine of swertiamarin in vivo transformation to coumarins. Methods: Through the design of chemical derivative method -LC/MS of metabolites were detected, Swertia bitter glycosides in vitro primary metabolites as erythrocentaurin, so the use of derivative of the methods to improve the detection sensitivity. The animal experiment and the liver microsomal incubation were carried out to verify the. Results: The specificity, precision, accuracy and stability of the samples were analyzed by LC/MS, and the average blood concentration, the maximum absorption time and the maximum drug curve were 425.8±127.6ng/mL,128.6min,38.8μg/mL·min respectively. Conclusion: Rat irrigation stomach Swertia bitter glycosides by plasma via deriving biochemical, success in the plasma detected erythrocentaurin, Swertia bitter glycoside first in vivo was hydrolyzed into aglycones. Most of the aglycone by rearrangement into erythrocentaurin, a Dihydrocoumarin first clarify Swertia bitter glycosides of rats in vivo metabolites, found that it can into the monoterpene compounds of alkaloids, coumarins, and its metabolites in the form of play a pharmacodynamics. Study on the metabolism of the compounds in the body of the cyclic ethers.

Key words:Swertia Gentiopicroside;Coumarin;Chemical Derivatization

收稿日期：(2015-05-14)编辑：曾文雪

中图分类号：R284.1

文献标识码：A