一种快速检测粪便中血红蛋白的胶体金方法

★　吴丹　程扩荣　舒雄　(.江西省药品审评中心　南昌 330046；.江西省金洹医疗器械股份有限公司　南昌330000)

一种快速检测粪便中血红蛋白的胶体金方法

★吴丹1程扩荣2舒雄2(1.江西省药品审评中心南昌 330046；2.江西省金洹医疗器械股份有限公司南昌330000)

摘要：本文介绍了一种快速检测粪便中血红蛋白的方法的工艺过程及在医学领域上的分析性能研究。用免疫学方法检测人粪便样本中出现的人血红蛋白，样本中出现的血红蛋白先与金标抗体形成抗原-金标抗体复合物，依靠毛细作用在纤维膜上层析，运行到检测线时，遇到包被抗体形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测区出现一条红色条带，结果为阳性。 这种胶体金方法具有优良的特异性，可以有效的检测出人体中的血红蛋白，并且不会受到药物与饮食方面的影响，在医学领域具有重要意义。

关键词：标记技术；胶体金；便潜血；免疫层析

便隐血是指消化道出血量很少，肉眼无法观察，并且红细胞被消化分解，显微镜也无法观察的一种临床表现，对消化道出血诊断具有重要的临床意义。免疫胶体金法是以胶体金作为标记物，利用抗原抗体特异性反应，通过有颜色的胶体金颗粒放大免疫反应的系统，让结果直接在固相载体上显现出来，主要是用于就检测样品中含有的抗原或抗体[1]。它利用抗人血红蛋白与人血红蛋白有高度特异性的特点检测便隐血。不受动物的血、肉、含过氧化物酶的蔬菜水果、铁剂、维生素C的影响，因此不需控制饮食。免疫胶体金法具有优良的稳定性、灵敏度、精确度及制造过程中的可重复性特点[2-3]，在临床各种疾病导致出血的诊断中都起到了准确的效果。

1材料

1.1主要药品和耗材

名称规格生产厂家碳酸钾AR天津市光复精细化工研究所十二水合磷酸氢二钠AR西陇化工股份有限公司二水合磷酸二氢钾AR西陇化工股份有限公司三羟甲基氨基甲烷BR国药集团化学试剂有限公司柠檬酸苏州亚科化学试剂股份有限公司蔗糖AR西陇化工股份有限公司牛血清白蛋白上海源生物科技有限公司酪蛋白BR上海克林生物科技有限公司吐温-20CP西陇化工股份有限公司柠檬酸三钠BR国药集团化学试剂有限公司氯金酸天津市化学试剂厂抗Hb单抗北京万城科技有限公司鼠抗Hb抗体北京万城科技有限公司羊抗属IgG抗体北京万城科技有限公司PVC板300*60mm上海生物科技有限公司硝酸纤维素膜25mm*50m上海生物科技有限公司聚酯纤维膜661325cm*30cm上海生物科技有限公司GF-08玻璃纤维膜20cm*30cm上海生物科技有限公司H-1吸水纸20cm*30cm上海生物科技有限公司

1.2仪器与设备DF-101S恒温加热磁力搅拌器(金坛市科兴仪器厂);FA1104B电子天平(上海越平科学仪器有限公司);TG20KR-D高速冷冻离心机(长沙东旺实验仪器有限公司);101-2电热恒温干燥箱(上海东星建材试验设备有限公司);FGS510台式划膜喷金机(杭州峰航科技有限公司).

2方法与操作

2.1免疫胶体金的制备方法

2.1.1制备胶体金采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，具体方法如下：

量取100 mL工艺用水加入到平底烧瓶中，置于恒温加热磁力搅拌器中，加入1%氯金酸溶液1.5mL，边加热边搅拌至沸腾。沸腾10min后，量取4mL的1%柠檬酸三钠溶液，迅速一次性加入到容器中，继续加热煮沸10min，停止加热，室温冷却。冷却后，将胶体金溶液补水至100mL，使用紫外分光光度计扫描鉴定，400～600nm的紫外扫描。来确定最大的吸收峰波长。制备的胶体金的最大吸收峰的波长为530nm。

2.1.2配制溶液

(1) 0.2 mol/L碳酸钾溶液：在100 mL 蒸馏水中溶解2.76 g碳酸钾，摇晃15 min，充分溶解。

(2) 0.01mol/l PB缓冲液：准确称取2.5 g磷酸氢二钠和0.49 g磷酸二氢钾，溶于1000 mL蒸馏水中，充分溶解，测量所配溶液的pH值。

(3) 1%柠檬酸三钠溶液：准确称取1 g的柠檬酸三钠于100 mL蒸馏水容器中。

(4) 1%氯金酸溶液：将1g的氯金酸固体充分溶解在100mL蒸馏水容器中。

(5) 10%酪蛋白：准确称取1 g酪蛋白于10 mL蒸馏水容器中，37 ℃水浴加热。

(6) 10%牛血清白蛋白：准确称取1 g牛血白蛋白于10 mL蒸馏水容器中。

(7)FOB检测线包被液：用微量枪准确量取9.3mg/mL的鼠抗人FOB抗体0.038 mL，加入到0.162 mL的0.01 MPB缓冲液中，充分混匀15 min，终体积0.2 mL。使鼠抗人FOB抗体的终浓度为3.0 mg/mL即用即配。

(8)FOB质控线包被液：用微量枪准确量取12 mg/mL羊抗鼠IgG抗体0.034 mL，加入到0.166 mL的0.01MPB缓冲液中，充分混匀15min，终体积0.2mL。使羊抗鼠IgG抗体的终浓度为3.0 mg/mL即用即配。

(9) 胶体金结合物稀释液：准确称取1.2 g 三羟甲基氨基甲烷于80 mL蒸馏水容器中，加入适量的柠檬酸于容器中，调节pH值(在7.60±0.10范围内)。准确称取5.0 g蔗糖、0.3g牛血清白蛋白、0.35g酪蛋白于容器中，再准确量取5 mL吐温-20加入到容器中，40 ℃水浴可全部溶解。用蒸馏水加到体积100 mL，溶液充分溶解。

2.2固相硝酸纤维素膜

2.2.1质控线喷液量的选择将羊抗属IgG抗体稀释到2mg/mL，使用自动划膜喷金机喷涂质控线，分别为1.4,1.2,1.0,0.8μL/cm，比较用不同喷涂量，得到划线的效果。结果显示1.0μL/cm喷涂量时，所划线部分边缘整齐，线条精细。

2.2.2硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被当喷涂量为1.0μL/cm时，将抗Hb单抗稀释至2mg/mL，质控线羊抗属IgG抗体稀释到2mg/mL，分别包被硝酸纤维素膜的质控线和检测线。37℃干燥5h。

2.3胶体金-抗体结合条件的选择

2.3.1鼠抗FOB单抗与胶体金结合取10个10mL 小烧杯，每个加入2mL的胶体金溶液，加入4μL鼠抗FOB单抗溶液，每个分别加入0.2M的碳酸钾溶液0,2,4,6,8,10,12,14,16,18μL；测定pH值及观察每个烧杯的胶体金的颜色。结果见表1。随着碳酸钾的量逐渐增加，胶体金的颜色变得更深，pH值不断增大。但是6号管中pH和颜色度符合要求，确定1mL 加入5μL的碳酸钾溶液。

2.3.2胶体金结合物制备分别取1mL的离心管3个，加入1mL的胶体金溶液，按照比例加入0.2M的碳酸钾溶液5μL，混匀，静置10min；按照每毫升加入2μL的比例加入鼠抗FOB单抗，混匀，静置30min；分别按照1%的比例加入胶体金稳定剂10μL，混匀，静置10min；4℃ 10000r/min离心10,15,20min，观察上清液的浑浊程度。结果显示离心15min效果最好。

2.4操作

2.4.1预检将离心后的胶体金结合物稀释至0.6倍，稀释后的溶液按照3mL浸泡100cm2试纸条，37℃干燥3～5h，裁条宽度为1cm，裁好的试纸条与样本垫、硝酸纤维素膜等材料依次粘贴，切条后使用人血红蛋白纯品检测。结果剑表2。结果显示检测阳性质控品1～5均为阳性，检测阴性参考品为阴性结果。

表1　不同碳酸钾溶液量的实验结果

表2　预检结果

2.4.2金标反应膜的制备

表3　金标反应膜组成

注：(1)抗FOB单抗的包装规格会有不同，但是100板的总量都是1.5 mg ；(2)此规格每张的有效长度以20 cm计，每板的宽度为1 cm。

2.4.3胶体金溶液的制备量取180 mL工艺用水加入到平底烧瓶中，加入1%氯金酸溶液5mL，边加热边搅拌至沸腾。沸腾5min后，量取8mL的1%柠檬酸三钠溶液，迅速一次性加入到容器中，继续加热煮沸5min，停止加热，室温冷却。冷却后，将胶体金溶液补水至100mL。

2.4.4胶体金-抗体结合物制备加入150mL的胶体金溶液，按照比例加入0.2M的碳酸钾溶液0.75mL，混匀，静置10min；按照每毫升加入4μL的比例加入鼠抗FOB单抗0.5mL，混匀，静置30min；按1%的比例加入胶体金稳定剂1.5mL，混匀，静置20min；4℃ 15000r/min离心20min，收集沉淀。

2.4.5金标反应膜制备(100板)加胶体金结合物稀释液90mL混匀，制得金标抗体溶液，将金标抗体溶液按照每100cm2聚酯纤维膜3mL均匀涂布，每张需要18mL金标抗体溶液，37℃干燥3～5h。

将晾干的金标反应膜按照指定的宽度进行分切(一般是10±1mm)，记作金垫。用铝箔袋密封，室温下存放。

2.4.6硝酸纤维反应膜的制备

2.4.6.1包被羊抗鼠IgG抗体(质控线)、鼠抗Hb抗体(检测线)使用0.01M的PB溶液分别稀释至2mg/mL，分别加入到自动划膜喷金机对应的位置；将设备的喷涂量为1μL/cm，质控线和检测线的间隔为5mm即对应的喷涂嘴相差5mm。包被后的硝酸纤维素膜，37℃干燥3～5h。

2.4.6.2分切将晾干的硝酸纤维素膜用铝箔袋密封，记作硝酸纤维膜，室温下存放。

表4　硝酸纤维反应膜清单

注：(1)PVC板沿板上的虚线标志撕开；(2)将硝酸纤维膜对应的贴在PVC板部分。

2.5试纸条

2.5.1试纸条的主要组成成分

表5　试纸条的主要组成成分

注：(1)PVC板沿板上的虚线标志撕开；(2)将硝酸纤维膜对应的贴在PVC板部分。

2.5.2试纸条的组成、结构及示意图试纸条主要是油样本垫、金标垫、包被膜、吸收垫及其PVC板组成。试纸条的示意图见图1。

图1　胶体金法试纸条示意图

3分析性能研究将组装好的试纸条进行检验，分别进行阴性检验、最低检测限、重复性、特异性及稳定性检验。

3.1试纸条的阴性检验抽取10分试纸条，使用公司内部的阴性参考品(主要是磷酸盐缓冲液)分别加入100μL进行检测，均为阴性。检验结果符合试纸条的要求。

3.2试纸条的最低检测限检验取30份试纸条，用浓度为0.4,0.2,0.1 μg/mL的人血红蛋白样本液分别加入100μL进行检测，结果见表6。结果显示，在人血红蛋白浓度值为0.2 μg/mL时，检验结果显示的弱阳性，是符合试纸条检验要求。

表6　试纸条最低检测线检验结果

3.3试纸条的重复性检验取10份试纸条，用2 μg/mL的血红蛋白样本液分别加入100μL进行检测，检验结果显示阳性，颜色的强度是均一的。符合试纸条的检验要求。

3.4试纸条的特异性检验取3份试纸条，使用500 μg/mL的猪血红蛋白和牛血红蛋白、2000 μg/mL辣根过氧化物酶分别加入100μL进行检验，结果显示阴性，说明试纸条对猪、牛血红蛋白和辣根过氧化物酶没有特异性。

4展望

胶体金免疫法测定便隐血，方法简单、快速、对人体无害，具有高的灵敏度与特异性，但是仍存在一些问题，如只能定性不能定量检测；样本放置一段时间对检测的影响较大，易出现假阴性结果上消化道出血量较大时，发生前带现象而产生假阴性结果；检测过程中发生假阳性现象。随着不断的研究和发展，胶体金法检测便隐血也会得到不断地完善，为科学、临床方面开辟新的途径。

参考文献

[1] 蔺俐仲，徐春志，靳朝.免疫胶体金技术及其在兽医临川上的应用[J].动物医学进展，2007，28(2)：106-109.

[2] 惠胜先.胶体金(wH)试纸条检测粪便隐血方法的优缺点[J].现代妇女(医学前沿)，2004(1)：98-99.

[3]邓兆享，彭杰雄.粪便隐血试验几种常用方法的比较与分析[J].检验医学与临床，2009,(7)：512-513.

A Colloidal Gold Method Which can Rapidly Detect the Hemoglobin From Human Feces

WU Dan1, CHENG Kuo-rong2, SHU Xiong2

1.Drugapprovalcenterinjiangxiprovince,Nanchang330046,China

2.JiangxiJinhuanMedicalInstrumentCo.,LTD,Nanchang330046,China

Abstract:This paper introduced the process and the performance of a method which can rapidly detect the hemoglobin from the feces.The hemoglobin which was detected from the human feces by the immunological methods, with the gold mark antigen will form a new antigen -gold mark antibody complex which was chromatography on the fiber membrane by the action of the capillary. When it moved to the test line where met the coating antibody, antibodies-antigen-gold mark compounds began to emerges, then a red line which represented positive in the detection area will appear.The method of the colloidal gold has a good specificity that it can effectively detect the hemoglobin in the human feces ,avoiding the impact of the drugs and the dietary.So it plays a great significant role in the field of the medicine.

Key words:Labeling Technique;Colloidal Gold;Feces Occult Blood;Immune Chromatography

收稿日期：(2015-05-22)编辑：曾文雪

中图分类号：R446.6

文献标识码：A