抗菌肽对猪源大肠杆菌和猪链球菌体外抑菌活性研究

胡 昌 宋 明 河南省济源市畜牧局动物卫生监督所 459000

1 材料和方法

1.1 材料

（1）试验菌株。8 株猪大肠杆菌（E.coil）分离自大肠菌感染的猪体，8 株猪链球菌株分离自感染的病猪，均来源于河南省内猪场，由河南农业大学牧医工程学院传染病实验室自行分离保存。

（2）试剂和药物。抗菌肽和牛肉膏（生化试剂）购自北京奥星生物技术有限公司，批号20070720；蛋白胨（生化试剂）购自北京奥星生物技术有限公司，批号20081102；氯化钠（分析纯）购自天津北方天医化学试剂厂，批号20080924；磷酸氢二钾（分析纯）购自上海恒信化学试剂有限公司，批号20080602。

（3）仪器。电热温恒温培养箱：HG303-4 南京实验仪器厂制造；净化工作台：SW-CT-1C 苏净集团安泰公司生产；手提式不锈钢蒸汽消毒器：YX280B上海三申医疗器械有限公司；双目生物显微镜：CX21日本奥林巴斯。

1.2 方法

（1）菌种的复苏和纯化。将实验室保存猪源大肠杆菌的甘油菌种划线接种营养琼脂平板培养基，猪链球菌接种于血平板，37℃培养24 小时，挑取单个菌落，涂片染色镜检，观察细菌的大小和形态，选取典型菌体进行试验。

（2）细菌接种量的确定。用普通肉汤培养基将抗菌肽原液倍比稀释为1／10 倍~1／2560 倍9 个浓度，加入灭菌试管中。两种细菌每组随机选取4 株，用生理盐水将猪源大肠杆菌和猪链球菌以镜检计数方式配成1×107cfu·mL、1×106cfu·mL、1×105cfu·mL、1×104cfu·mL4 种浓度的细菌悬液，分别接种于含不同药物梯度的普通肉汤培养基中。另做不含药物的培养基，接种菌悬液，作为生长菌的空白对照。于37℃培养24 小时观察各菌株的生长情况，以未有细菌生长的最小药物浓度为MIC。

（3）试管稀释法对最小抑菌浓度（MIC）的确定。取抗菌肽原液0.2mL 以相应的普通肉汤培养基倍比稀释成1／10 倍、1／20 倍、1／40 倍、1／80 倍、1／160 倍、1／320 倍、1／640 倍、1／1280 倍和1／2560 倍9 个浓度移入小试管，两种细菌每组随机选取4 株，用生理盐水将大肠杆菌和猪链球菌菌株分别以镜检计数法方式配成1×105cfu·mL 的菌悬液，分别在不同的药物梯度试管中加入20mL 菌液，另做不含药物的培养基接种菌悬液，作为生长菌的空白对照。样品于37℃培养，36h 观察细菌生长情况，分别测定菌种的MIC。

2 结果

2.1 细菌接种量的确定

由表l 看出 ，在相同培养条件下，抗菌肽的最小抑菌浓度随细菌浓度的增加而不断提高，在细菌浓度范围为1×104cfu·mL 和1×l05cfu·mL 之间为规则上升，之后MIC 的变化不规则。为了获得较好的数值并获得较一致的试验结果，本试验将菌株接种浓度确定为1×105cfu·mL 进行抑菌试验。

表1 不同的细菌浓度对抗菌肽最小抑菌浓度的影响

2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定

表2 抗菌肽对猪源大肠杆菌和猪链球菌最小抑菌浓度的测定结果

采用普通肉汤培养基倍比稀释法，结果测得抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度和对猪链球菌的抑菌作用。抗菌肽对大肠杆菌的MIC 为原液的1／160~1／80 倍之间。抗菌肽对猪链球菌的MIC 明显小于大肠杆菌的MIC 为1／1280~1／640 倍之间，只表明抗菌肽对猪链球球菌的体外抑菌效果明显优于大肠杆菌。从表2 看出，抗菌肽对猪源的大肠杆菌和猪链球球菌的抑菌作用有较大差异，对大肠杆菌的MIC 较高，为原液的1／160~1／80 倍之间，而对猪链球球菌的MIC 较低，为1／1280~1／640 倍之间。

3 讨论

3.1 关于抗菌肽对猪源大肠杆菌和猪链球菌最小抑菌浓度(MIC)

培养温度和培养时间相同时，抗菌肽对大肠杆菌和猪链球菌的MIC 与接种细菌的浓度和培养时间相关，试验时应选择适当菌量，本试验在预试验中通过测定不同细菌浓度对抗菌肽最小抑菌浓度的影响。抗菌肽对猪源大肠杆菌和猪链球菌的抑制作用有较大的差异，究及原因可能与大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，链球菌属于革兰氏阳性菌有关，两种细菌的细胞壁结构有较大的差异，因此对抗菌肽的耐受性不同。

3.2 关于抗菌肽在动物生产中的应用

不同来源和不同种类的抗菌肽抗菌特征具有相似性，即具有广谱抗菌活性，同时对肿瘤细胞也有杀伤作用。研究者发现抗菌肽可促进动物生长，提高动物抗病能力，不易产生耐药性。此外，结合基因工程技术培育转基因动物也是动物养殖的一种新途径。Yarus 用显微注射法将牛气管AMP 基因转入小鼠，转基鼠成功地表达了牛气管AMP，鼠乳中的牛气管AMP 对大肠杆菌具有抗菌活性。可见抗菌肽转基因动物具有明显增强抗病原微生物的能力，这在动物养殖中具有重要的现实意义。同时昆虫抗菌肽被认为最具有发展前景的绿色饲料添加剂。抗生素饲料添加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生物平衡，并且容易在动物体内残留，使生态环境中的细菌在与动物接触中产生耐药性，严重影响畜产品的品质和人类的健康，进而影响整个生态环境。

随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深化，应用抗菌肽作为饲料添加剂，可克服耐药菌株的产生，而抗菌肽成分为易吸收的氨基酸，动物通过饲喂添加抗菌肽的饲料，可增加其对疾病的抵抗力，促进生长。因此用基因工程方法生产特异性抗菌肽添加剂，或通过日粮调控抗菌肽基因的表达，从而达到畜产品无抗生素化，提高我国畜产品的国际竞争力。当然抗菌肽作为饲料添加剂的研究还处于探索阶段，要形成成熟的技术、大规模的应用到动物生产中还有很多问题需要解决。抗菌肽的种类很多，哪些种类作为饲料添加剂效果较好而且又比较经济，不同种类的抗菌肽之间是否有相互作用，也有待于进一步研究。由于抗菌肽的分子小，直接提取天然抗菌肽时，分离提纯存在一定的困难，故化学合成和基因工程法成为获得抗菌肽的主要手段，但是化学合成抗菌肽成本很高。通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因时，容易被蛋白酶降解，表达产物可能对宿主有害，需要用脂质包被或对其进行化学修饰来保护，因此还需对它的释放机制、受体结合降解活性及其类似物的结构与活性等进行研究。