海藻酸降解菌的筛选及其在刺参发酵饵料制备中的应用

郭 　航，　张 天 任，　孙 　兴，　黄 忠 刚，　肖 　珊，　王 　晗，　王 际 辉

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连　116034；

2.大连博仕奥生物科技有限公司， 辽宁 大连　116085 )



海藻酸降解菌的筛选及其在刺参发酵饵料制备中的应用

郭 航1，张 天 任1，孙 兴1，黄 忠 刚2，肖 珊1，王 晗1，王 际 辉1

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连116034；

2.大连博仕奥生物科技有限公司， 辽宁 大连116085 )

摘要:从穿孔海带中筛选出一株能降解海藻中海藻胶且对刺参无致病性的细菌D。经16S rDNA鉴定，该菌株为假交替单胞菌。将该株假单胞菌与实验室保藏的EM菌混合后对海参饵料进行固态发酵,接种量为3%，接种比例为褐藻酸降解菌与EM菌的体积比为1∶2，含水量45%，温度28 ℃，发酵周期为5 d，并对发酵后的饵料品质进行评价。结果表明，发酵饵料气味更鲜香。通过发酵，饵料粗蛋白及还原糖的质量分数分别增加了11.40%和136.31%，粗纤维、粗灰分及褐藻酸的质量分数分别降低了13.17%，16.20%及32.50%。

关键词:褐藻酸降解菌；刺参；发酵饵料；固态发酵

Screening of alginate degrading bacteria and its application

0引言

刺参(Apostichopusjaponicas)富含丰富的胶原蛋白和多聚糖，并且含有钙、铁、锰等多种微量元素，具有较高的食用和药用价值，是我国北方重要的海产经济动物之一。随着刺参养殖业的不断发展，复合饵料等相关行业也随之发展。然而，目前海参营养需求方面的研究还不成熟，缺乏相关的标准，海参饵料也呈现出营养不全面，消化吸收利用率低等现象[1]。

王吉桥等[2]研究刺参肠道酶活时发现刺参肠道中褐藻酸酶及纤维素酶活力较低。然而刺参饵料的主要成分为富含褐藻酸和纤维素的藻类[3]。研究表明，适量的益生菌能够提高水产动物的生长率及消化酶活力[4-5]。因此，可以通过饵料发酵以提高利用率，在发酵过程中，益生菌迅速繁殖并成为优势菌群，能够抑制有害菌、致病菌的生长，从而降低刺参的发病率，提高其成活率。益生菌发酵可以将饵料中的大分子蛋白质降解为多肽、小肽及游离氨基酸，除去多种抗营养因子，提高饵料消化吸收率[6]。发酵饵料中富含的活性菌体还能起到净化水质的作用，枯草芽孢杆菌、光合细菌及乳酸菌等能够有效降低刺参养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐及硫化氢水平[7-9]。因此，发酵饵料还有可能对刺参池塘养殖倒池周期的延长做出贡献。与液体发酵相比，采用固态发酵的方式在很大程度上降低了发酵饵料的含水量，使饵料便于贮存和运输，对发酵饵料的大规模生产和推广具有重要的经济价值和现实意义[10]。

本实验从海洋环境中筛选出能够降解褐藻酸和纤维素等大分子物质的益生菌，并与实验室保藏的EM菌混合，对刺参饵料进行固态发酵，以改善饵料的适口性，提高饵料的利用率，以期为刺参复合营养饵料的开发提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种来源

从大连渤海湾野生刺参肠道、鲍鱼肠道及穿孔海带中分离筛选褐藻酸降解菌；EM菌(枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌)为实验室保藏菌株。

1.1.2培养基

(1)初筛培养基：海藻酸钠0.5%，(NH4)2SO40.5%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，NaCl 2.5%，琼脂1.3%，FeSO4·7H2O 0.01%；pH 7.5[11]。

(2)复筛培养基

液体种子：蛋白胨0.5%，酵母提取物0.1%，海藻酸钠0.5%，NaCl 3%；pH 7.5。

摇瓶复筛培养基：海藻酸钠0.5%，(NH4)SO40.5%，K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，NaCl 2.5%；pH 7.5[12]。

(3)EM菌培养基

乳酸菌液体种子培养基：牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏0.4%，葡萄糖2%，蔗糖1%，乙酸钠0.5%，柠檬酸铵0.2%，K2HPO40.08%，MgSO4·7H2O 0.02%，MnSO40.005%，轻质碳酸钙0.1%，吐温80 1 mL；pH 6.2。

芽孢杆菌液体种子培养基：牛肉膏1%，蛋白胨1%，葡萄糖1%，NaCl 0.5%；pH 7.0～7.2。

酵母菌液体种子培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；自然pH。

(4)发酵培养基：黄腐酸0.5%，酵母膏0.64%，尿素0.18%，味精0.09%，NaCl 0.09%，香菇粉0.125%，KH2PO40.31%，轻质CaCO31.5%，红糖5.6%；自然pH。

1.2菌株的分离筛选

1.2.1平板初筛

将从海底取回的新鲜刺参、鲍鱼用无菌解剖法取出肠道内容物，并将取回的穿孔海带切碎，将肠道内容物和海带于低温条件下(4 ℃)匀浆，并用灭菌海水按10-1～10-6浓度梯度稀释[13]。取0.1 mL稀释液涂布于初筛培养基上，25 ℃恒温培养2～5 d，挑取降解圈明显不同的菌落进行编号，记录菌落颜色、状态、降解圈大小。分离纯化后，挑至斜面培养基保藏。

1.2.2复筛

将初筛的菌种接入50 mL种子培养基中，25 ℃、150 r/min培养20 h；取对数生长期的种子液以2%的接种量接种到100 mL发酵培养基中，25 ℃、150 r/min摇床培养24 h；最后在4 ℃、8 000 r/min 条件下离心20 min，取上清，按照汤海青[14]的方法测定酶活，并测定生长曲线。

1.2.3安全性试验

取80只个体大小相近的健康刺参(800头)，分成4组(空白、B、D、S)，于玻璃缸中喂养，玻璃缸装水量为9 L，每2 d换一次海水，换水量为1/2，日投饵量为刺参体重的3%。驯化一周后，每组投5×109cfu/mL菌液，空白对照组加入等量的海水，每日观察记录刺参健康状况，并计算存活率，实验周期为10 d。

1.2.4菌株的鉴定

将纯化好的菌种送至大连华大基因研究中心进行菌种鉴定。16S rDNA测序结果使用NCBI的Blast软件与Gene Bank数据库中的已知种类微生物的16S rDNA基因序列进行比对，得到相似度最高的序列，并绘制系统发育树。

1.3发酵饵料的制备

1.3.1饵料配方

脱胶海带粉32%，马尾藻粉20%，海青粉20%，玉米粉6%，破壁酵母粉5%，发酵豆粕4%，虾粉4%，预混料4%，鱼粉3%，扇贝边粉2%，红糖1%。

1.3.2发酵条件

设置对照组和试验组2个处理组，对照组为未发酵的饵料，试验组为EM菌混合褐藻酸降解菌发酵组，EM菌及褐藻酸降解菌的添加量分别为每10 kg干料添加200和100 mL菌液，调整水分质量分数为40%～45%。密封装袋后于室温发酵，根据外界温度的不同发酵天数为5～7 d。

1.4发酵饵料的品质评价

1.4.1感官评价

对发酵饵料进行取样、观察、记录，对比发酵前后饵料的颜色、气味、黏度及对刺参的诱食效果。

1.4.2理化指标测定

粗蛋白的测定采用凯氏定氮法，具体方法参见GB/T 6432—1994《饲料中粗蛋白的测定方法》；粗纤维的测定采用快速测定法[15]；粗灰分的测定采用灼烧法，具体方法参见GB/T 6438—2007；还原糖的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[16]；褐藻胶含量测定采用醋酸钙法[17]；以上实验每组设置3个平行。

1.5数据统计分析

用SPSS Statistics 20.0统计分析软件对实验各处理组进行Anova分析(P<0.05)。

2结果与讨论

2.1菌种的分离筛选

2.1.1菌株筛选

根据菌落形态及其在初筛培养基表面形成的降解圈大小，在3个样品中共筛选出24株具有褐藻酸降解能力的菌株。经过复筛筛选出褐藻胶降解效果好并且性状稳定的3种菌株B，D，S。

2.1.2安全性试验

投菌12 h后，B菌试验组刺参全部沉底，不再贴壁生长。刺参出现摇头、腐皮现象，其余3组刺参生长状况良好。36 h后，B菌试验组有部分海参出现自溶；S菌试验组有一只海参死亡，对照组及D菌试验组刺参生长状况均良好。养殖10 d 后，对照组、B菌组、D菌组及S菌组刺参存活率分别为95%，20%，95%及90%，因此淘汰B菌株和S菌株。在养殖试验期间还发现，D菌组的水质比对照组澄清，说明筛选出的菌株可以降解掉池底残饵中多余的褐藻胶，对养殖水体水质起到一定的改善作用。

2.1.3生长曲线及褐藻酸酶活测定

对D菌进行生长曲线测定，结果如图1所示，D菌的调整期比较短，2～18 h为对数生长期，稳定期较长，说明可以长时间的保持菌种活力。酶活为0.933 U/mL，比汤海青[14]、武玉勇[18]等的测定值小，因而在后续实验中进一步优化D菌的产酶条件以达到更佳酶活。

2.1.416S rDNA分析结果

D菌株的16S rDNA基因测序结果表明，该菌的16S基因大小为1 285 Da。根据Blast软件分析，与该序列相似度大于99%的序列来自于Pseudoalteromonas种属的细菌，该序列与Pseudoalteromonas_sp._UST041101-043序列的相似度最高，最大匹配度为44%，因此该菌株被鉴定为Pseudoalteromonas.sp。Pseudoalteromonas属系统进化树见图1。Pseudoalteromonas菌种特征：海洋细菌，短杆状，乳白色，菌落表面湿滑，革兰阴性菌(G-)，好氧。

图1　D菌的16S rDNA系统发育树

2.2发酵饵料品质评价

2.2.1感官评价

饵料感官评价结果见表1。未发酵饵料呈土黄色，发酵饵料颜色发生变化，趋近于海泥的颜色；气味上，未发酵饵料带有海藻的腥味，而发酵料由于乳酸菌在代谢过程中产生了乳酸，不仅可以降低pH抑制有害微生物生长，而且使饵料呈现乳酸的酸香味，与姜燕等[10]发酵的海参饵料效果一致。发酵过程中，芳香类物质的产生使饵料同时具有海鲜的鲜香味；饵料发酵后，黏度增加，能与海泥更好地混合，将饵料投喂海参，发现发酵饵料对海参的诱食性更强。

表1　饵料的感官评价

2.2.2理化指标评价

以粗蛋白、粗纤维、粗灰分、还原糖及褐藻酸为指标的理化评价见表2。

2.2.2.1粗蛋白

由于发酵体系中加入活菌，菌体在适宜的载体中大量繁殖，利用环境中的营养物质在体内产生一些必需的蛋白质及氨基酸类的代谢产物，使饵料粗蛋白含量有所增加。从表2中可以看出，发酵饵料的粗蛋白质量分数为20.32%，比未发酵饵料提高了11.40%。发酵后的刺参饵料的蛋白含量符合朱伟等[19]研究的刺参的增重率范围。王吉桥等[20]研究表明，刺参在养殖高温期对蛋白质的需求量增加，因此可以通过发酵的方式提高饵料中的蛋白质含量，从而减少饵料蛋白质的补充。

表2　饵料的理化指标评价

2.2.2.2粗纤维

发酵饵料粗纤维质量分数为18.59%，比未发酵组降低了13.17%。马尾藻、海带及豆粕中都含有刺参不容易消化的纤维素，芽孢杆菌、乳酸菌等代谢产生的纤维素酶可以有效降解饵料中难以消化的纤维素，使饵料更容易消化分解，提高饵料的营养价值[21]。

2.2.2.3粗灰分

发酵组粗灰分质量分数为33.22%，比未发酵组降低了16.20%。这可能是由于发酵体系中含有大量的微生物，可以通过自身代谢作用将饵料中的部分无机物转化为可以被刺参利用的有机物，提高了饵料的利用率。饵料中存在的大量活菌还可以起到降低养殖水体富营养化，减少底泥腐败和环境污染的作用。

2.2.2.4还原糖

发酵过程显著地提高了海参饵料的还原糖含量，发酵组还原糖质量分数为4.23%，比未发酵料增长了1.36倍。这可能是由于芽孢杆菌及乳酸菌能产纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等多种酶类，这些酶作用于饵料中含有纤维素、淀粉、碳水化合物的海藻、豆粕，将其细胞壁分解为非结构性碳水化合物，还原糖量增加[22]。同时酵母菌也能分泌胞外酶将非还原糖转化为还原糖[23]，并且产生乙醇，这也是发酵饵料酒香气味的来源。还原糖含量的增加可以改善饵料的适口性，增加其对刺参的诱食性。

2.2.2.5褐藻酸

发酵组褐藻酸质量分数为8.95%，比未发酵料降低了32.5%。海带及海藻等大型藻类中含有高黏度且不易被刺参消化吸收的褐藻酸及多糖，褐藻酸降解菌产生的褐藻酸裂解酶能有效降解褐藻酸并生成小分子活性寡糖，更有利于刺参消化吸收，提高饵料的利用率[24-25]。此外，由于饵料发酵后海藻酸含量降低，可以在饵料中增加海带的比例来替代部分价格昂贵的马尾藻，达到节约企业成本的目的。

3结论

本研究用从穿孔海带中筛选出一株能降解海藻褐藻胶的菌株D，经16S rDNA鉴定，该菌株为假交替单胞菌。安全性试验表明，菌液浓度到达5×109cfu/mL时对刺参无致病性，可用其发酵刺参饵料，产褐藻酸酶活力为0.933 U/mL。

与普通的未发酵饵料相比，用含有褐藻酸降解菌的EM菌发酵的刺参饵料能减少饵料的腥味，气味更好。发酵后的饵料粗蛋白及还原糖质量分数分别增加了11.40%和136.31%，粗纤维、粗灰分及褐藻酸质量分数分别降低了13.17%，16.20%及32.50%。

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in fermented feed for sea cucumberApostichopusjaponicas

GUOHang1,ZHANGTianren1,SUNXing1,HUANGZhonggang2,

XIAOShan1,WANGHan1,WANGJihui1

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；

2.Dalian Boss-all Biological Science and Technology Limited Company, Dalian 116085, China )

Abstract:An align-degrading bacteria D was isolated and purified from perforated kelp, which was non-pathogenic for sea cucumber. The strain was Pseudoalteromonas identified by 16S rDNA. Apostichopus japonicas baits were fermented with bacteria D and EM bacteria, which inoculum size was 3%; volume proportion of bacteria D and EM bacteria was 1∶2; moisture was 45%; temperature was 28 ℃; fermented time was 5 d, and qualities of bait were evaluated after fermented. The results showed that the fermented feed’s flavor was more delicious and attractive for Apostichopus japonicas. The mass fraction of crude protein and reducing sugar were increased by 11.40% and 136.31% respectively, while crude fiber, crude ash and alginate were reduced to 13.17%, 16.20% and 32.50% respectively.

Key words:alginate degrading bacteria; Apostichopus japonicas; fermented bait; solid-state fermentation

文章编号:1674-1404(2015)06-0396-05

通信作者：

作者简介:郭 航(1989-)，女，硕士研究生；王际辉(1970-)，男，教授.

基金项目:国家海洋公益性行业科研专项项目(201405003)；国家海洋食品工程技术研究中心资助(2012FU125X03)；辽宁省教育厅创新团队项目(LT2014010)；辽宁省科技计划项目(2014211003)；辽宁省高等学校重大科技平台项目(2011191).

收稿日期:2014-12-19.

中图分类号:TS201.3；Q815

文献标志码:A