高压脉冲电场辅助提取牛脊髓中的糖脂类物质

鲍妮娜，高贵珍，单玲玲，于蓓蓓，王晓慧

1.宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000；2.即墨市食品药品监督管理局，山东青岛，266200；3.东方海洋科技股份有限公司，山东烟台，264003



高压脉冲电场辅助提取牛脊髓中的糖脂类物质

鲍妮娜1，高贵珍1，单玲玲1，于蓓蓓2，王晓慧3

1.宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000；2.即墨市食品药品监督管理局，山东青岛，266200；3.东方海洋科技股份有限公司，山东烟台，264003

采用响应面法，对牛脊髓中糖脂类物质的提取进行优化。对电场强度、脉冲数和液料比进行了单因素考察，建立了一个3水平的优化设计。根据响应面优化和二次回归方程分析得到糖脂类物质提取的优化条件为：电场强度19.7kV/cm，脉冲数为9.1，液料比为11。在此优化条件下，得到的糖脂类物质的质量为0.318g/5g牛脊髓，与预测值0.319g/5g牛脊髓相符，说明所建立的模型的模拟值可以采纳。同时，比较了高压脉冲电场辅助溶剂提取技术与传统的提取方法(加热提取、超声波提取)在提取牛脊髓中糖脂类物质的作用效果。结果表明，高压脉冲电场辅助溶剂法提取糖脂类物质的效果更佳，它不仅能耗少且作用时间短。

糖脂类；高压脉冲电场；牛脊髓；响应面

目前国内外学者对牛脊髓的研究有以下几个方面，如牛脊髓中的可溶性酸性蛋白[1]、牛髓鞘碱性蛋白[2]、牛脊髓前角匀浆的作用机制[3]、致脑炎病毒[4]、内源性脑啡肽降解酶抑制剂[5]等，却鲜见对牛脊髓中糖脂类物质的报道。

糖脂类物质属于脂类物质，传统的提取脂类物质的方法一般采用有机溶剂进行提取，如氯仿-甲醇法等，但有机溶剂提取法对环境污染严重，产品毒性大。也有采用超声波辅助溶剂提取法和超临界流体萃取[6-10]等方法，鲜有利用高压脉冲电场辅助提取脂类物质的报道[11-14]，利用高压脉冲电场提取牛脊髓中的糖脂类物质，国内外没有相关的文献报道。

本文的主要内容是考察不同的提取方法(常温提取、超声波辅助溶剂提取法、高压脉冲电场辅助提取法)对牛脊髓中的糖脂类物质提取的影响，分析比较三种提取方法在提取牛脊髓糖脂类物质中的不同的作用效果。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

牛脊髓(长春市皓月集团)，石油醚、丙酮、氯仿、甲醇、硫酸、乙醇、间苯二酚、盐酸等试剂均为分析纯。薄层层析板(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)、高效薄层层析板(青岛化工公司)。

高压脉冲电场提取装置LDT-200，专利产品[15]；超声波细胞粉碎机(昆山市超声仪器有限公司)；高速冷冻离心机(D-37520O型，sterodeKendroLaboratoryProducts)；旋转蒸发器(RE-52AA型，上海雅荣生化仪器设备有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 传统的提取方法

牛脊髓切块称重，取5g左右，加入一定量的4℃的90%的乙醇溶液，于粉碎机中粉碎1min。分别采用超声波辅助溶剂提取和常温提取的方法提取糖脂类物质。

1.2.2 高压脉冲电场辅助有机溶剂提取

处理同1.2.1，将粉碎后得到的混合液搅拌均匀，在室温条件下，立即将溶液通入高压脉冲电场处理装置，在一定的电场强度下以不同的脉冲数处理。

1.2.3 响应面(Box-Behnken)试验设计

以液料比、电场强度、脉冲数作为影响牛脊髓中糖脂类物质的主要因素。将这3个因素作为自变量X1、X2、X3，每个因素设置3个水平，以-1、0、+1进行水平编码。牛脊髓中糖脂类物质的响应值如式(1)所示。

(1)

式中，Yi为牛脊髓中糖脂类物质对应的峰面积；β0，βi，βii及βij分别为方程的一次项，二次项及交互项系数；Xi、Xj为因素自变量。

经过单因素试验选取自变量取值范围，因素水平编码如表1所示。据此进行中心组合试验设计，每组试验重复3次，结果取平均值，并采用Design-Expert软件进行回归模型分析。

1.2.4 脑苷脂类和神经节苷脂类物质的初步鉴定

提取得到的牛脊髓浓缩物加入一定量的石油醚，离心，得到的沉淀物即为粗脑苷脂，上清液减压真空浓缩，浓缩液中加入一定量的丙酮，离心，得到的沉淀物即为粗神经节苷脂。粗脑苷脂点样到薄层层析板上，用三氯甲烷/甲醇/水为10∶1∶0.2展开剂展开后，用5%的乙醇硫酸溶液喷射，在110℃下加热5min，出现黄褐色的印迹。粗神经节苷脂点样并经展开剂氯仿/甲醇/0.2%氯化钙展开后喷射间苯二酚-盐酸溶液，然后置于110℃的环境中加热5min，出现紫红色的印迹。

表1 因素水平编码表

2 结果与讨论

2.1 电场强度对牛脊髓中糖脂类物质的影响

糖脂类物质的量随着电场强度的增加而增加，当其电场强度达到20 kV/cm后，提取得到的糖脂类的量基本平稳，此时的糖脂类物质的提取量为0.14 g/5g牛脊髓。由图1可以看出，糖脂类物质所占浓缩物的比例随着电场强度的增加先增加后减少，当电场强度为20 kV/cm时，糖脂类物质所占的比例达到最高值为93.33%，在20～25 kV/cm之间，所占比例基本保持了平衡，后又随之减少。因此选择电场强度为20 kV/cm，作为最佳的试验条件。

图1 电场强度对牛脊髓中糖脂类物质的影响

2.2 脉冲数对牛脊髓中糖脂类物质的影响

牛脊髓中糖脂类物质的质量随着脉冲数的增加而增加，当脉冲数为10时，达到最大量为0.16 g/5g牛脊髓，这表示可以继续加大脉冲数，也即可以延长作用时间。由图2可以看出，牛脊髓中糖脂类物质占浓缩物的比例随着脉冲数的增加而增加，当脉冲数为8时，其所占比例明显增大；当脉冲数为10时，其所占比例较之脉冲数为8时略有增加，但幅度较少。因此，选择脉冲数为10时作为提取牛脊髓中糖脂类物质的条件。

图2 脉冲数对牛脊髓中糖脂类物质的影响

2.3 液料比对牛脊髓中糖脂类物质的影响

牛脊髓中的糖脂类物质随着液料比的增加而增加，当液料比为7时，糖脂类物质的质量为0.26 g/5g牛脊髓，继续加入溶剂，得到的糖脂类物质的质量变化不大。由图3可以看出，随着液料比的增加，牛脊髓中糖脂类物质所占浓缩物的比例先增加后减少，当液料比为7时，所占的比例最大。因此选择料液比为7时作为提取牛脊髓中糖脂类物质的条件。

图3 液料比对牛脊髓中糖脂类物质的影响

2.4 Box-Behnken中心组合设计与结果

响应面优化比传统的优化有很多的优点，如节省时间、空间和原材料等。本试验设计了17个试验点的响应面分析试验，其中12个析因点，包含5个零点试验。试验方案与结果如表2所示。

表2 牛脊髓中糖脂类物质重量的中心组合试验设计及响应值

(续表)

2.5 二次回归模型建立与方差分析

对试验数据进行多项式回归分析，建立二次响应回归模型，拟合得到二次回归方程，如式(2)所示，并对回归方程进行方差分析，如表3所示。

R1=+0.22+6.250×10-3X1+0.015X2+0.019X3-7.500×10-3X1X3+0.030X2X3-0.037X12-0.025X22+0.058X32

(2)

上述二次回归模型方程的回归系数R2=0.990 0，模型的F值为76.74，说明此分析是显著的。从回归模型的方差分析结果可以看出(表3)，所建立的模型能很好地反映试验数据，回归方程的拟合度较好，试验误差小。基于回归方程的因素显著性分析，在显著水平为P<0.01条件下，模型中的一次项脉冲数X2(P=0.0004)、液料比X3(P<0.0001)，二次项X12、X22和X32，交互项行X2X3均表现极显著；在显著水平为P<0.05条件下，一次项X1，表现显著；其他则表现不显著。模型的失拟项P=0.9442>0.05，表明失拟不显著，即该模型是稳定的，能较好地预测不同因素组合处理后牛脊髓中糖脂类物质质量的变化情况。因此，可以采用此模型对牛脊髓中糖脂类物质质量进行分析和预测。

表3 回归模型的方差分析

2.6 响应面和等高线图

图4 电场强度和脉冲数的交互作用对牛脊髓中糖脂类物质提取的影响

利用Design-Expert 7.0软件设计响应面试验，研究参数及其交互作用对牛脊髓中糖脂类物质提取的影响。三维响应面和二维等高线图显示反应和每个变量的实验水平之间的交互作用。如图4所示，当液料比保持在零水平时，电场强度和脉冲数对牛脊髓中糖脂类物质提取的交互作用。如图5所示，当电场强度保持在零水平，脉冲数和液料比对牛脊髓中糖脂类物质提取的交互作用。图6表明，当脉冲数保持在零水平时，电场强度和液料比对牛脊髓中糖脂类物质提取的交互作用。通过分析，牛脊髓中糖脂类物质最大的提取条件为：电场强度为19.7 kV/cm，脉冲数为9.1，液料比为11。依照此优化条件进行验证试验，重复3次，平均值为0.318g/5g牛脊髓。试验结果与模型优化模拟结果基本一致，说明模型可靠性较高，能较好地预测实际情况。因此可以得出结论，模型是可用的，并且其优化了提取条件。

图5 脉冲数和料液比的交互作用对牛脊髓中糖脂类物质提取的影响

图6 电场强度和液料比交互作用对牛脊髓中糖脂类物质提取的影响

图4为电场强度和脉冲数的交互作用图，由图可以看出，随着电场强度和脉冲数的增加，牛脊髓中糖脂类物质的质量快速增加，但在场强达到20 kV/cm以后，所提取的物质的量呈现快速下降的趋势，这极有可能是因为场强的增加影响了其中物质的结构，因此导致其提取率下降[16-17]。此外，牛脊髓中糖脂类物质随脉冲数的增加也先出现了快速的上升，后又呈现下降的趋势，脉冲数的大小反映了高压脉冲电场的作用长短[18-19]，这可能是由于作用时间过长导致其中物质的变化，从而影响了牛脊髓中糖脂类物质的提取。图5为脉冲数和液料比的交互作用图，由图可以看出，牛脊髓中糖脂类物质的质量随着脉冲数的增加先增加后又减少，可以看出电场作用时间较长时将影响糖脂类物质的提取。同样的，牛脊髓中糖脂类物质的质量随着液料比的增加先减少后迅速上升，说明液料比的增加，增加了电场的导电性，从而使提取的糖脂类物质的质量明显增加。图6为场强度和液料比的交互作用图，由图可以看出，二者之间的交互作用比较明显，所提取的牛脊髓糖脂类物质先随着强度的增加而增加，后又表现出减少的趋势；牛脊髓中糖脂类物质的质量先随着液料比的增加而减少，后又快速的上升，说明随料液比的增加使电场的导电性能增加，从而加强对牛脊髓的作用效果，糖脂类物质增多。

2.7 高压脉冲电场和传统提取方法的比较

为了更好地比较高压脉冲电场和传统的提取方法在提取牛脊髓中糖脂类物质中的作用，所有的实验用牛脊髓材料均购于皓月集团。表4所示为高压脉冲电场与传统提取方法在牛脊髓糖脂类物质提取中的比较，由表可以看出，虽然高压脉冲电场的作用时间只有6 μs，但是提取所得到的牛脊髓糖脂类物质的质量明显多于加热3 h和超声波作用1 h的提取量。高压脉冲电场辅助溶剂法得到的糖脂类物质的量比加热提取和超声波提取的分别高1.74和1.25倍，效果明显。此外，高压脉冲电场与传统的提取方法比还具有非加热的性能，可以避免加热带来的不良的影响，同时还可以节省能源[20]。

表4 高压脉冲电场和传统提取方法的比较

3 结 论

本文采用响应面法，对牛脊髓中糖脂类物质的提取进行了优化。对电场强度、脉冲数和液料比进行了单因素考察，建立了一个3水平的优化设计。结果表明，响应面优化设计对牛脊髓中糖脂类物质的提取是可行的。根据响应面优化和二次回归方程分析得到糖脂类物质提取的优化条件为：电场强度19.7 kV/cm，脉冲数为9.1，液料比为11。在此优化条件下，得到的糖脂类物质的质量为0.318 g/5g牛脊髓，与预测值0.319 g/5g牛脊髓相符，这足以说明所建立的模型的模拟值是可以采纳的。同时，比较了高压脉冲电场辅助溶剂提取技术与传统的提取方法(加热提取、超声波提取)在提取牛脊髓中糖脂类物质的作用效果，结果表明，高压脉冲电场辅助溶剂法提取糖脂类物质的效果更佳，它不仅能耗少且作用时间短。

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(责任编辑：汪材印)

Extracting glycolipids in bovine spinal cord using PEF-assisted organic solvent

BAO Nina1，GAO Guizhen1，SHAN Lingling1，YU Beibei2，WANG Xiaohui3

1.School of Biological and Food Engineering,Suzhou University,Suzhou 234000,China 2.Jimo food and drug administration,Qingdao,266200；3.East ocean science and technology co.,Yantai,264003

In this paper the extraction of glycolipids (cerebroside and ganglioside) in bovine spinal cord was investigated using response surface methodology (RSM).The quantitative effects of field strength,pulse numbers,ratio of liquid to raw material,and a three-level Box-Behnken design which was based on the results of a single-factor test was employed to optimize the parameters for extraction of glycolipid.By solving the regression equation and also by analyzing the response surface contour plots,the optimal glycolipid extraction conditions were determined: field strength 19.7kV/cm,pulse numbers 9.1 and ratio of liquid to raw material 11,and the weight of glycopilid extraction was 0.318g per 5g bovine spinal cord.And the extraction of glycolipid by HIPEF is better than other traditional technologies.

Glycolipids; HIPEF; Bovine spinal cord; RSM

2015-10-19

鲍妮娜(1984-)，女，山东烟台人，博士，讲师，主要研究方向：天然产物提取与开发。

R284.2

：A

：1673-2006(2015)12-0115-05

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.12.031