早胜牛A-FABP基因SNPs与胴体品质和肉质性状的关系

赵生国，唐红杰，焦 婷，刘立山，周 瑞，徐振飞(.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 70070； .甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 70070；.庆阳市农业科学研究院， 甘肃 庆阳 745000)

动物生产层

早胜牛A-FABP基因SNPs与胴体品质和肉质性状的关系

赵生国1，唐红杰1，焦 婷2，刘立山1，周 瑞1，徐振飞3
(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070；3.庆阳市农业科学研究院， 甘肃 庆阳 745000)

为研究早胜牛(Bostaurus)A-FABP基因多态性与胴体品质和肉质性状的相关性，采用PCR-SSCP方法对5个早胜牛群体(庆阳群体、平凉群体、南德温与庆阳杂种群体、西门塔尔与平凉杂种群体、秦川与平凉杂种群体)A-FABP基因型进行了测定，并分析其多态性与胴体品质和肉质性状的相关性。结果表明，A-FABP基因第2外显子区c.280A>G，并检测到3种基因型AA、AG和GG。对屠宰后胴体和肉质性状相关分析表明，基因型AG屠宰率极显著高于AA(P<0.01)，而净肉率GG极显著高于AA(P<0.01)；基因型AG剪切力显著低于AA(P<0.05)。由此认为A-FABP基因突变位点可作为早胜牛胴体性状和肉质性状遗传标记。

早胜牛，A-FABP基因； SNPs； 胴体品质； 肉质性状

脂肪型脂肪酸结合蛋白基因(Adipocyte Fatty Acid Binding-protein Gene，A-FABP)主要在脂肪细胞中表达，在甘油三酯形成及脂肪分解过程中对脂肪生成或溶解起调控作用[1]。Wulf等[2]将牛(Bostaurus)的该基因定位在14号染色体上，其625 bp的mRNA编码了132个氨基酸。有研究表明鸡(Gallusgallus)[3]和猪(Susscrofa)[4]的A-FABP基因只在脂肪组织中表达，其有利于肌内脂肪含量的增加，且鸡[5-6]、鸭(Anasplatyrhynchos)[7]、猪[8]和牛[9-11]等的A-FABP基因变异可能影响肌间脂肪(IMF)沉积，而Armstrong等[12]进一步表明该基因可作为肌肉大理石花纹的候选基因，且对皮下脂肪和背部脂肪[13]厚度都存在影响。鉴于此，本研究利用PCR-SSCP技术对5个甘肃早胜牛群体的A-FABP基因第2外显子多态性及其与肉质性状的相关性进行了分析，以期筛选甘肃地方牛种肉质性状相关分子标记，为良种肉牛选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用取样器采集牛耳组织，置于75%酒精中在-20 ℃保存，采用常规的酚/氯仿法[14]提取基因组DNA，TE溶解后对DNA质量进行检测，然后稀释成100 ng·μL-1备用。

随机选取庆阳群体和西杂牛69头进行胴体性状测定，屠宰前称重，屠宰后分别测定胴体性状(胴体重、屠宰率、胴体背膘厚、眼肌面积、净肉率)和肉质性状(大理石花纹等级、肉色、失水率、剪切力、pH值、蒸煮损失)，所检测个体为相同条件下无亲缘关系的22月龄健康阉牛，参照《养牛学》[15]方法进行测定。

1.2 引物设计及PCR扩增体系

采用Primer Premier 5.0软件，以EMBL(ENSBTAT00000000079)发表的牛A-FABP基因序列为参照，设计A-FABP基因第2外显子引物(由上海生物工程有限公司合成)。引物序列：Forward primer：5‘-GGGGTGTGGTCACCATTAAA-3’，Revserse primer：5’-TGGTTTGCTATAGGCAGCAG - 3’，PCR反应总体系25 μL：Premix Taq 12.5 μL(1.25 U)，基因组DNA 1 μL(100 ng·μL-1)，引物各0.5 μL(10 pmol·μL-1)，ddH2O 10.5 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸140 s，循环30次；72 ℃延伸10 min，反应结束后 4 ℃保存。

1.3 扩增产物检测及SSCP分型

产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，取2 μL加入到8 μL上样液[去离子甲酰胺(98%)、pH 8.0的10 mmol·L-1EDTA、二甲苯氰FF(0.025%)、溴酚蓝(0.03%)]中，经96 ℃变性12 min后冰浴15 min，采用12%丙烯酰胺凝胶(Acr∶Scr=29∶1)检测，160 V电泳10 h后银染。

表1 样品信息Table 1 Information of samples

1.4 测序

根据SSCP分型结果，挑选不同基因型的个体PCR扩增产物送至北京三博生物技术有限公司测序。

1.5 数据分析

根据SSCP分型结果计算基因型频率和等位基因频率，利用PopGen 3.2分别计算纯合度(Ho)和杂合度(He)及有效等位基因数(Ne)，进行Hardy-Weinberg平衡检验和卡方独立性检验，计算多态信息含量(PIC)。用SPSS 19.0的GLM(General linear model)完成模型Yij=μ+GENi+LOCj+(GEN×LOC)ij+eij(Yij：个体某性状表型值；μ：群体均值；GENi：基因型效应；LOCj：地区效应；GEN×LOC)ij：基因型与地区的互作效应；eij：随机误差)的最小二乘方差分析。

2 结果与分析

2.1 SSCP分型及测序结果分析

SSCP分型表明存在3种基因型(图1)，测序结果与发表在GenBank中的序列(NM174314)进行比对，在A-FABP基因第2外显子c.A280>G处发现一个突变位点，即A→G碱基突变(图2)。

2.2 A-FABP基因遗传多态性分析

根据SSCP检测结果进行分析发现，5个群体的A-FABP基因中，GG基因型频率均低于AG基因型频率(表2)。在5个早胜牛群体中，除南杂牛和秦杂牛A等位基因频率均高于G等位基因频率表现为优势等位基因外，其他3个群体G等位基因频率均高于A等位基因频率。χ2适合性检验表明，平凉群体c.280A>G的χ2值没有达到显著水平，说明基因型处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，其他4个群体处于Hardy-Weinberg非平衡状态(P<0.05)。

图1 早胜牛A-FABP基因第2外显子PCR-SSCP检测结果Fig.1 The 2nd exon ofA-FABPgene in Zaoshen Cattle detection by PCR-SSCP

注：从左到右的5个泳道分为别早胜牛庆阳群体中的QZ4和QZ5个体(AG基因型)、QZ17和QZ56个体(AA基因型)、QZ72个体为(GG基因型)。

Note: Individual of QZ4 and QZ5(AG), QZ17 and QZ56(AA), QZ72(GG) in Qingyang population of Zaosheng Cattle showed in five channels from left to right.

图2 A-FABP基因第2外显子测序结果Fig.2 The sequence results of the 2nd exon ofA-FABPin Zaosheng Catttle

注：纯合子AA在第280位置为碱基A，杂合子AG在第280位置的碱基分别为A和G，纯合子GG在第280位置为碱基G。

Note: Homozygous AA at position 280 is the base A, heterozygous AG at the position 280 is base A and G, GG homozygous at position 280 is the base G.

表2 A-FABP第2外显子基因型频率和基因频率Table 2 Frequencies of genotypes and alleles of the 2nd exon inA-FABP

注：括弧中的数字是各群体中具有不同基因型的个体数。

Note： Individual numbers of genotype in each population were shown in brackets.

χ2独立性检验表明(表3)，秦杂牛、南杂牛与西杂牛基因型分布差异显著(P<0.05)，且与平凉和庆阳群体基因型分布差异极显著(P<0.01)；其他群体间基因型分布差异不显著(P>0.05)。

表3 A-FABP基因第2外显子基因型独立性检验Table 3 The independent test of genotypes in the 2nd exon inA-FABPgene

注：*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。下同。

Note: *, significant difference at 0.05 level; **, extremely significant difference at 0.01 level. The same below.

表4表明了5个群体A-FABP基因第2外显子c.280A>G位点的纯合度(Ho)、杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)及多态信息含量(PIC)。庆阳早胜牛群体的纯合度最高(0.502 6)和杂合度最低(0.497 4)，而西门塔尔牛与早胜牛平凉杂交群体纯合度最低(0.492 6)和杂合度最高(0.507 4)；秦川牛与早胜牛平凉杂交群体有效等位基因数最多(1.999 2)；其中各群体PIC含量约为0.37，处于中度多态(0.25

表4 A-FABP基因遗传多态性分析Table 4 The genetic polymorphisms ofA-FABPgene

注：PIC<0.25为低度多态，0.250.5为高度多态。

Note:PIC<0.25 means low diversity, 0.250.5 means high diversity.

2.3 基因型与胴体、肉质性状的相关性分析

对A-FABP基因第2外显子不同基因型中的7个胴体性状进行方差分析发现，AG基因型屠宰率极显著高于AA(P<0.01)、GG净肉率极显著高于AA(P<0.01)，3个基因型间的其他性状差异不显著(P>0.05)(表5)。

对A-FABP基因第2外显子不同基因型的6个肉质性状(肉色、切力、失水率、大理石花纹和剪蒸煮损失及pH值)分析发现(表6)，AG基因型剪切力显著低于AA(P<0.05)，基因型间其他性状差异不显著(P>0.05)。

表5 A-FABP基因型与胴体性状关联分析Table 5 Correlation of polymorphism ofA-FABPgene with carcass traits

表6 A-FABP基因基因型与肉质性状关系Table 6 Correlation of genotype ofA-FABPgene with meat quality

3 讨论与结论

3.1 A-FABP基因第2外显子变异分析

研究表明在秦川牛A-FABP基因第1内含子和第4外显子上发生突变[9]，而且发现鲁西牛、南阳牛、郏县红牛和夏南牛等国内地方牛中该基因两端侧翼序列及第2和3外显子也存在变异[16]，朝鲜牛2、3、4外显子也存在突变位点[17]。本研究对早胜牛及其杂交群体A-FABP基因第2外显子的研究发现，因编码区c.280A>G变异位点的存在而界定出3种基因型(AA、AG、GG)，Dong-yep等[17]对朝鲜牛A-FABP基因中的检测中也发现了这一突变位点[17]。χ2适合性检验表明，平凉群体的基因型符合Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，表明在遗传漂变、迁徙和人工选育等相互作用下处于动态平衡中；而其他4个群体处于Hardy-Weinberg非平衡状态(P<0.05)，说明自然选择或者人工选择对基因分布产生了较大影响，造成了分布上的不平衡，可能与高强度选择有关。χ2独立性检验结果表明，秦杂牛、南杂牛与西杂牛基因型分布差异显著(P<0.05)，且与平凉群体和庆阳群体差异极显著(P<0.01)，证实不同群体间存在遗传差异，由于遗传背景及选择压力的差异，形成了不同程度的变异。Chakraborty等[18]认为有效等位基因数(Ne)、杂合度(He)和多态信息含量(PIC)是衡量群体遗传多态性的主要指标，且其值具有一致性。5个群体的多态信息含量均为0.37，处于中度多态(0.25

3.2 基因多态性与肉质性状的相关性

Wood等[19]研究认为，肌内脂肪(Intramuscular Fat,IMF)含量与肉的嫩度和风味有直接关系，而A-FABP基因是影响动物肌内脂肪含量的重要候选基因[10]。

对秦川牛的A-FABP基因多态性研究表明，牛肉嫩度、背膘厚及大理石花纹等指标与第1内含子上的变异有关，同时发现第4外显子上的纯合基因型GG个体的背膘厚和嫩度值及大理石花纹评分显著高于CC[9]。刘艳妍[16]研究发现两端侧翼序列与牛的产肉性状相关；第2外显子的变异与屠宰率、嫩度、眼肌面积和胴体长相关；第3外显子及3′侧翼序列变异分别与眼肌面积和胴体深相关。Cho等[13]和Dong-yep等[17]分别对该基因外显子2和3的研究也得到了相同结果。Barendse等[20]认为，在外显子3和内含子3之间存在的剪接位点突变与澳大利亚肉牛肌间脂肪沉积显著相关。

Dong-yep等[17]报道了与本研究相同的研究结果，即在A-FABP基因第2外显子上存在错义突变位点c.280A>G，该碱基突变导致编码的异亮氨酸(IIe)变为缬氨酸(Val)，可能会导致蛋白质的空间结构发生变化，进而影响其功能的发挥。该SNPs与朝鲜牛的胴体重、背膘厚相关性未达到显著水平，这与本研究结果基本一致。基因型AA屠宰率极显著高于AG(P<0.01)、AA净肉率显极显著高于GG，基因型AG剪切力显著低于AA(P<0.05)。对A-FABP基因变异位点与牛体胴体品质和肉质等主要经济性状的关联分析，认为A-FABP多态位点可作为肉牛肉质性状遗传效应的分子标记。

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(责任编辑 张瑾)

Correlation analysis between SNPs ofA-FABPgene and characteristics of carcass and meat quality in Zaosheng Cattle

ZHAO Sheng-guo1, TANG Hong-jie1, JIAO Ting2, LIU Li-shan1, ZHOU Rui1, XU Zhen-fei3
(1.Faculty of Animal Science and Technology, Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China;2.Faculty of Pratacultural Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;3.Qingyang Academy of Agricultural Search, Qingyang 745000, China)

In order to study the polymorphism ofA-FABPgene and its correlation with the characteristics of carcass and meat quality in Zaosheng cattle (Bostaurus), the SNPs ofA-FABPgene in five groups of Zaosheng cattle (Qingyang, Pingliang, Hybrid of Qingyang with South Devon, Hybrid of Simmental with Pingliang and Hybrid of Qinchuan with Pingliang) were detected using PCR-SSCP and their characteristics of carcass and meat quality were analyzed. The results showed that there was a base mutation at c.280 A>G ofA-FABPgene in exon 2 which lead to three genotypes AA, AG and GG. The statistical correlation analysis indicated that dressing percentage of AG genotype was extremely significantly higher (P<0.01) than that of AA genotype. Percentage of net meat in GG genotype was extremely significantly higher (P<0.01) than that of AA genotype. The WBSF of AA genotype was significantly higher (P<0.05) than that of AG genotype. These results suggested that the site mutation ofA-FABPgene could be considered as maker to carcass and meat quality.

Zaosheng cattle;A-FABPgene; SNPs; carcass quality; meat quality traits

ZHAO Sheng-guo E-mail:zhaosg@gsau.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0316

2014-07-02 接受日期：2014-09-29

甘肃省高等学校科研项目(2013A-069)

赵生国(1976-)，男，甘肃庆城人，讲师，博士，研究方向为动物遗传资源保护与利用。E-mail:zhaosg@gsau.edu.cn

S823

A

1001-0629(2015)07-1150-06*

赵生国，唐红杰，焦 婷，刘立山，周 瑞，徐振飞.早胜牛A-FABP基因SNPs与胴体品质和肉质性状的关系[J].草业科学,2015,32(7):1150-1155.

ZHAO Sheng-guo,TANG Hong-jie,JIAO Ting,LIU Li-shan,ZHOU Rui,XU Zhen-fei.Correlation analysis between SNPs ofA-FABPgene and characteristics of carcass and meat quality in Zaosheng Cattle[J].Pratacultural Science，2015,32(7)：1150-1155.