显色剂加入方式及结果计算方法对土壤磷酸酶测定结果的影响

贝美容+罗雪华+杨红竹

（中国热带农业科学院橡胶研究所 海南儋州 571737）

摘 要 为探讨有色显色剂的加液方式及加入量对显色后溶液吸收值的影响、标准曲线的绘制及结果计算方法对土壤磷酸酶测定值的影响，取广东橡胶园0～20 cm土样为材料，以磷酸苯二钠为基质，酶解土壤释放出酚，与显色剂氯代二溴对苯醌亚胺反应，以标准曲线法求出样品测试液的酚浓度，比较以不同加液方式加入不同量的显色剂对溶液吸收值的影响，同时比较用直线或一元二次曲线等两种标准曲线回归方程对样品测试液酚浓度的影响。结果表明：以胶头滴管滴加或以移液枪用多次重复使用过的吸嘴加入显色剂，显色后溶液吸收值变异系数达3.33%～6.44%，而以活塞式定量加液器加入，其变异系数在1.28%以下，且随着加入量增大变异系数降低至0.51%，重现性好；当配制的标准曲线浓度范围较宽且相应吸收值较高（接近0.9），以曲线法求得的标准曲线回归方程决定系数（R2=0.999 8）大于直线回归的（R2=0.999 7），且曲线法求出的土壤无基质对照及试剂空白酚浓度比直线法更有实际意义。

关键词 土壤磷酸酶 ；显色剂 ；定量加液器 ；标准曲线 ；结果计算

分类号 O657

Abstract Effects of color development reagent dosing methods and dosing volumes on absorbance were investigated in this study， and effects of calculation methods on final values were also discussed in this study. Soil samples were collected in Guangdong rubber plantation from 0～20 cm layer， benzene disodium phosphate as the reactant， and chlorinated dibromo benzoquinoneimine as the color development reagent， the phenol concentration of tested sample solution be calculated using the standard curve methods. The effects of different dosing methods and dosing volumes of color development reagent on absorbance were compared and the phenol concentrations of tested sample solution were compared with linear or quadratic curve regression equation. The results showed that the coefficient of variation （CV） of the absorbance value ranged from 3.33% to 6.44% after adding different amounts of color development reagent using rubber dropper or pipette with continuous used tips， and CV was less than 1.28% using a piston dispenser， and CV was reduced to 0.51% with the amounts of the color reagent increasing. When standards of desired concentration range were wide， and the highest point of the standard series had a higher absorbance value， for example， the absorbance value of the highest standard closed to 0.9 in this experiment， the coefficient of determination of the standard curve regression equation based on a quadratic fit （R2=0.999 8） was higher than on a linear fit（R2=0.999 7） ， and the phenol concentration of tested blank without disodium phenyl phosphate and the reagent blank were more meaningful using the regression equation based on a quadratic fit than based on a linear fit.

Keywords soil phosphatase ； color reagent； piston dispenser ； standard curve ； result calculation

土壤有机磷是土壤全磷的重要组成部分，约占土壤全磷的30%～80%[1-2]，但有机磷必须在土壤磷酸酶的作用下转化为无机磷后才能被植物吸收利用，因而土壤磷酸酶的活性直接影响土壤中磷的有效性。而土壤磷酸酶活性的准确定量是正确评价土壤有机磷转化强度和方向的前提和基础。常用的土壤磷酸酶活性测定方法是通过向土壤中添加苯基磷酸盐等基质，然后以比色法测定在磷酸酶的作用下水解后所生成的有机基团即苯酚的量，即为酶促基质形成产物的数量[2-5]。

由于土壤中存在一些与基质分解产物相似的化合物（如酚等）及基质自发分解的产物，它们将直接影响结果的准确性，在测定土壤磷酸酶活性时，都必须设置无基质对照和无土壤对照，计算酶活性时从试验样品数据中减去对照样品的，但在具体的显色、比色等操作步骤中，由于显色剂本身有颜色，显色剂的加入量、加液方式、参比溶液的选择，均会影响酶活性测定结果的准确性[6]，甚至因参比溶液选择不当导致结果计算时出现土壤酶活性为负值的现象。针对上述问题， 我们从显色剂的配制、移取方法、参比溶液的选择及标准曲线绘制、结果计算等方面对该法作了一些研究，供分析实验人员参考，以提高分析样品的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品

广东橡胶园土壤0～20 cm土样，3种不同的土质，基本情况见表1。

1.1.2 仪器

恒温培养箱；Lambda系列紫外/可见分光光度计。

1.1.3 试剂、标准系列

试剂均为分析纯；水为蒸馏水。甲苯；pH 5.0醋酸盐缓冲液；0.5%的基质溶液；pH 9.6硼砂-氢氧化钠缓冲液；显色剂；1 g/L酚原液；10 mg/L酚工作液。

1.2 方法

1.2.1 试剂、标准系列的配制

（1）pH 5.0醋酸盐缓冲液：分别取贮备液A 14.8 mL、贮备液B 35.2 mL，以水稀释至100 mL；贮备液A：0.2 mol/L醋酸溶液，即取95%的醋酸11.55 mL加水稀释至1 L；贮备液B：0.2 mol/L醋酸钠溶液，即取16.4 g醋酸钠（CH3COONa）或27.2 g CH3COONa·3H2O，加水溶解后稀释至1 L。

（2）0.5%的基质溶液：取5.826 g苯磷酸二钠（C6H5PO4Na2·2H2O） 溶于pH 5.0的醋酸盐缓冲液并稀释至1 L。

（3）pH 9.6硼砂-氢氧化钠缓冲液：分别取贮备液C 50 mL、贮备液D 23 mL，以水稀释至200 mL；贮备液C：0.05 mol/L硼砂溶液，即取19.05 g硼砂（Na2B4O7·10H2O）加水溶解后稀释至1 L；贮备液D：0.2 mol/L氢氧化钠溶液，即取8.0 g 氢氧化钠（NaOH）加水溶解后稀释至1 L。

（4）显色剂：取0.062 5 g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺（C6H2Br2ClNO），用40 mL 95%乙醇溶解（原方法[5]：0.125 g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺用10 mL 95%乙醇溶解），贮于棕色瓶中，存放在冰箱里，保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用（最好现配现用）。

（5）1 g/L酚原液：取1 g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1 L，贮于棕色瓶中。

（6）10 mg/L酚工作液：取10 mL 酚原液稀释至1 L。

1.2.2 测定原理

本法基于以苯磷酸二钠为基质，在pH 5.0醋酸盐缓冲液的酸性条件下，使酶解土壤释放出的酚与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生色，比色后按标准曲线法求出游离的酚量，用以表示酶的活性。

1.2.3 酶活性的测定

标准系列溶液的测定：取10 mg/L酚工作液0、0.5、1、2、3、5、7、8、9 mL置于25 mL容量瓶中，使用定量加液器每瓶分别加入2.5 mL pH 9.6的硼砂-氢氧化钠缓冲液和1 mL显色剂，显色后以水稀释至刻度，30 min后，于578 nm波长处比色，用1 cm比色皿，以蒸馏水作参比溶液调节仪器零点，测定其吸收值，该标准系列溶液相应酚浓度为：0、0.2、0.4、0.8、1.2、2、2.8、3.2、3.6 mg/L。

样品的测定：称取过1 mm筛的风干土样2.5 g，置于150 mL三角瓶中，加1 mL甲苯，轻轻摇动，15 min后，加入10 mL 0.5%的基质溶液，仔细摇匀后以保鲜膜封口，放入37 ℃恒温箱培养24 h。取出后加入90 mL水，摇匀，吸取10 mL离心，取1 mL清液于25 mL刻度试管，然后按绘制标准曲线所述方法显色，此液即为加基质样品测试液（简称为加基质样品）；同时，每个土样做无基质对照实验，即以10 mL pH 5.0醋酸盐缓冲液代替10 mL基质溶液，其余操作与加基质样品同样显色，此液为无基质对照测试液（简称为无基质对照），以排除土壤中原有的酚对实验结果的影响；同时与样品实验相同方法做无土对照实验，即不加入土壤，其余操作与加基质样品同样显色，此液为无土对照测试液（简称试剂空白），以检查试剂纯度和基质自生分解情况，每个样品重复3次。

因为显色剂本身是有颜色的，为比较不同量的显色剂、不同加液方式对溶液吸收值的影响，分别用胶头滴管、移液枪及活塞式定量加液器加入0.5、1、1.5 mL等不同量的显色剂，以水定容至25 mL，测定其吸收值，每个处理重复4次。

2 结果与分析

2.1 显色剂不同加入法对溶液吸收值的影响

不同量的显色剂、不同加入方法对溶液吸收值的影响结果见表2。从表2中可以看出，不论是哪种加入法，随着显色剂加入量的不断增加，溶液吸收值均不断增大，因此在酶活性测定过程中必须十分严格控制显色剂的加入量[7]，以准确加入所需的显色剂用量。

从表2中还可看出，用胶头滴管和移液枪加入显色剂，溶液吸收值的变异系数均大于3.33，且随着显色剂加入量的增大而增加至6.44，这可能是由于滴管加入，是由拇指和食指出力控制一滴一滴地加入，而每滴之间由于手控制力的差异，同时由于显色剂浓度高、且溶剂为高浓度易挥发的酒精，每滴之间微量的差异将导致显色后溶液吸收值的较大差异；而移液枪本身是精密仪器，但其塑料吸嘴由于重复使用，吸嘴尖端残留量不一及内壁易挂水珠等因素，致使移液枪加入法溶液的吸收值重复性也较差。

而活塞式加液器是利用注射器式针筒的柱塞往复运动和进水口、出水口两个单向活塞使液体定量、定向运动、进行加液，所加试液在试液导出管内相对较密闭，不存在液体挥发和挂壁现象，所以显色后溶液吸收值变异系数在1.28%以下，且随着显色剂加入量由0.5 mL增至1.5 mL，其变异系数反而减小，重复性更好，故我们优选活塞式定量加液器；同时降低显色剂的配制浓度，即取0.062 5 g氯代二溴对苯醌亚胺溶解于40 mL 95%的乙醇、但显色剂的加入量由文献的5滴[5]（约0.25 mL）扩大至1 mL，而总的氯代二溴对苯醌亚胺加入量保持不变，以减小测试误差，提高样品分析准确性。

2.2 土壤磷酸酶活性计算方法

本实验测得标准系列溶液显色后的吸收值分别为0.171、0.215、0.259、0.34、0.422、0.575、0.728、0.804、0.890。在由标准系列酚浓度及其相应吸收值求样品测试液的酚浓度时，在如今计算机普及的情况下，不用坐标纸绘图法，而参照一元线性回归在比色分析中的应用方法[8]，在Excel 2003或2007软件中，以标准系列溶液酚浓度为自变量（x），相应吸收值为因变量（y），插入XY散点图后绘得回归线，再选中该回归线后在添加趋势线的回归分析类型选项中，选择线性或多项式及相应的公式、R平方值等选项后，求得直线回归方程：y=0.197 2 x+0.178 2，R2=0.999 7，或一元二次曲线回归方程：y=-0.002 3 x2+0.205 5 x+0.174 8，R2=0.999 8。测定出的3种土壤加基质样品、无基质对照及试剂空 白显色后溶液的吸收值见表3。

由表3可知，3种土样的A无及试剂空白A0虽然都较高（达到0.17），且与上述标准空白接近，说明3种土样的无基质对照及试剂空白的酚含量接近标准空白，其吸收值较高是由于显色液带有颜色而引起的。

由各土样显色后溶液吸收值依据上述标准曲线回归方程求解拟合，求出其相应酚浓度C，平均值见表3，最后根据公式⑴求出各土壤样品磷酸酶活性，见表4。

由表4可知，用直线回归方程（简称直线法）求出3种土样的无基质对照及试剂空白的酚浓度在-0.006～-0.020，全部为负值，而由曲线回归方程（简称曲线法）求出3种样品的无基质对照及试剂空白的酚浓度在-0.002～0.011，其中也出现了负值，这可能是回归方程引入的一个固定的误差[9-10]，并非负浓度，说明3种土样本身所含酚类物质都较低，基质的自发分解也很弱，但曲线法求出3种土样的无基质对照及试剂空白的酚浓度比直线法更接近于正值，更有实际意义；且由于本实验配制的标准曲线浓度范围较宽，最高点酚浓度为0.36 mg /L，其吸收值相应较高（接近0.9），以曲线法求得的标准曲线回归方程决定系数（R2=0.999 8）大于直线回归的（R2=0.999 7），因此选择曲线法求出的各土样待测液的酚浓度进行计算，以表征土壤磷酸酶活性。

3 讨论与结论

土壤酶活性的测定与土壤常规分析略有不同，在土壤酶活性测定实验中，除了需设置试剂空白，每个土样还需设置无基质对照，若测定方法中显色剂本身是有颜色的（如本法土壤磷酸酶的测定），测试中建议以蒸馏水为参比溶液调节仪器零点，测出加基质样品、无土对照及试剂空白测试液的吸收值，再依据回归方程拟合求出其酚浓度；另外在测试未知土壤的磷酸酶活性时，若配制了浓度范围较宽的标准系列溶液，其最高浓度标准溶液的吸收值较高时，如本试验最高浓度标准溶液的吸收值接近0.9，建议以一元二次回归方程拟合求解样品测试液的酚浓度。

本实验以蒸馏水为参比溶液调节仪器零点的好处在于：对于显色剂本身是有颜色的情况下，能够测知标准空白测试液及无土对照测试液（即试剂空白）的吸收值高低；当空白测试液的吸收值过大时，结果计算时就不能采用扣除空白值的校正方法，而应当纯化试剂、提高蒸馏水质量等方法改进；若直接以标准空白或试剂空白为参比溶液调节仪器零点，虽可消除显色试剂中的待测组分产生吸收的影响，但很难发现试剂空白值的大小。

对于土壤磷酸酶活性测定方法中易挥发溶剂配制的带有颜色的显色剂，必须十分严格控制显色剂的加入量，使用加液路径相对较密闭的活塞式定量加液器，同时适当降低显色剂的配制浓度以扩大加入量，减小因量小浓度高而造成的误差，提高样品分析的精密度和准确度。

参考文献

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