1，25-（OH）2D3联合α-干扰素治疗四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的疗效研究

荣辰，康辉，郝奉天，陶志嵩

（中国医科大学附属第一医院检验科，沈阳 110001）

1，25-（OH）2D3联合α-干扰素治疗四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的疗效研究

荣辰，康辉，郝奉天，陶志嵩

（中国医科大学附属第一医院检验科，沈阳 110001）

目的探讨1，25-（OH）2D3联合α-干扰素（IFN-α）对四氯化碳（CCl4）诱导的BALB/c肝纤维化小鼠的治疗效果。方法应用10%CCl4（5 μL/g）制造肝纤维化小鼠模型成功后，将其随机分为盐水治疗组（0.9%生理盐水100 μL/只，n=6）、IFN-α治疗组（800 U/只，n=6）、1，25-（OH）2D3治疗组（50 μg/kg口服灌胃，n=6）和联合治疗组（同时给予2种药物，n=6），另设正常对照组（n=6）。应用病理组织学检测方法对各组小鼠进行肝脏纤维化分级及评分；采用实时定量PCR及酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞因子白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β（TGF-β）及信号转导蛋白Smad3的表达水平。结果病理组织学检查结果显示：联合治疗组小鼠肝脏炎性细胞浸润减少，CoI1α1含量降低；实时定量PCR及ELISA检测结果显示：IL-6、TNF-α、TGF-β、Smad3及IL-10的表达水平升高，但与两者单独治疗效果无显著差异。结论1，25-（OH）2D3联合IFN-α治疗CCl4诱导的小鼠肝纤维化效果与单独用药疗效相似。

肝纤维化；1，25-（OH）2D3；α-干扰素

在各种刺激下，肝脏内细胞外基质（extracellular matrix，ECM）产生和降解失衡，导致其过度增生与异常沉积，使肝脏结构破坏并产生肝脏功能异常，从而导致肝纤维化［1］。当肝脏受到损伤或感染肝炎病毒时，肝脏枯否细胞会释放肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等促炎性介质，直接或间接激活肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）由静息状态转变为活化状态，导致胶原形成。TGF-β能够刺激ECM合成，抑制ECM降解，是组织纤维化形成最重要的因子［2］。

1，25-（OH）2D3是维生素D的活性形式，其主要功能为调节钙磷代谢及骨钙盐沉积［3］。研究表明，1，25-（OH）2D3可以有效地调节先天性及适应性免疫功能及细胞的生长分化［4］，抑制肝脏、肾脏、肺及心肌纤维化的发展［5～8］。IFN-α是目前临床上治疗慢性丙型肝炎的首选药物，研究显示，它可能还能够通过调控肝脏免疫细胞和细胞因子水平发挥直接的抗纤维化效应［9～11］。1，25-（OH）2D3和IFN-α单独应用时均具有抗纤维化作用，且其相关机制有一定程度的交叉重叠，因此，本研究拟将二者联合应用于四氯化碳（CCL4）诱导的小鼠肝纤维化的治疗中，旨在评判二者联合治疗的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：6～8周龄、雌性BALB/c小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供（许可证编号：SCXK京200420001），18～22℃下自由进食普通杆状饲料，正常饮水。

1.1.2 主要试剂：CCl4（上海长江化工厂）；重组人IFN-α2b（美国先灵葆雅公司）；1，25-（OH）2D3（美国Sigma公司）；TRIzol（美国Invitrogen公司）；Prime-Script®RT reagent kit with gDNA Eraser（美国Takara公司）；SYBR®Premix Ex TaqTM（美国Takara公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝纤维化模型建立及分组：给予小鼠腹腔注射10%CCl4（橄榄油稀释，5 μL/g，3次/周）6周后，将其随机分为4组（每组6只）：盐水治疗组（0.9%生理盐水100 μL/只，皮下注射，隔日1次），IFN-α治疗组（800 U/只，皮下注射，隔日1次），1，25-（OH）2D3治疗组（50 μg/kg，口服灌胃，隔日1次）和联合治疗组［同时给予800 U/只IFN-α皮下注射和50 μg/kg 1，25-（OH）2D3口服灌胃］。另设正常对照组（n=6），给予小鼠0.9%生理盐水（100 μL/只）皮下注射，隔日1次。治疗6周后，取各组小鼠肝脏组织进行相关检测。

1.2.2 组织学检测及肝纤维化分级评分：取小鼠肝脏组织切片后行HE及Masson染色，并进行纤维化分级及评分。肝纤维化分级标准［12］：0级，正常；Ⅰ级，存在纤维化（汇管区纤维化扩大，局限窦周及小叶内纤维化）；Ⅱ级，轻度纤维化（汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，小叶结构保留）；Ⅲ级，中度纤维化（纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化）；Ⅳ级，严重纤维化（纤维间隔变厚，许多假小叶形成）。将所得分级结果做下列转化后再做肝纤维化评分统计［13，14］：0级=20；Ⅰ级=21；Ⅱ级=22；Ⅲ级=23；Ⅳ级= 24。

1.2.3 实时定量PCR检测CoI1α1、IL-6、IL-10、TNF-α及Smad3 mRNA的表达水平：提取肝组织中总RNA，将mRNA反转录为cDNA后，行实时PCR。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95℃5 s，制熔解曲线。反应结束后，分析各样本的CT值，即达到一定荧光阈值的循环数。用β-acti n作为内参进行校正。

1.2.4 ELISA法检测细胞因子表达水平：双抗体夹心ELISA法检测小鼠肝细胞培养上清中IL-6、IL-10、TNF-α及TGF-β的含量，酶标仪（InterMedNJ-2100）测定OD450nm值，绘制标准曲线，计算含量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠肝脏组织病理变化及纤维化分级评分

2.1.1 各组小鼠肝脏组织学变化：正常对照组可见肝小叶结构完整，肝索排列整齐，无炎性细胞浸润，汇管区无纤维化，肝小叶间未见纤维组织增生；盐水治疗组可见肝小叶结构被破坏，肝索排列紊乱，有炎性细胞浸润，肝细胞水肿，脂肪变性明显，汇管区大量炎性细胞浸润，纤维间隔形成伴小叶结构紊乱，汇管区纤维组织增生；IFN-α治疗组和1，25-（OH）2D3治疗组可见汇管区少量炎性细胞浸润，汇管区纤维组织增生，少量纤维间隔形成，小叶结构完整；联合治疗组与各单独治疗组变化相似，无明显差异。见图1，图2。

2.1.2 各组小鼠肝脏组织纤维化分级情况及评分：如表1所示，生理盐水治疗组小鼠纤维化评分较正常组显著上升（P＜0.05），表明肝纤维化程度加重。应用IFN-α和1，25-（OH）2D3单独及联合治疗组小鼠纤维化评分较生理盐水治疗组显著下降，但联合治疗并未更好地缓解肝纤维化，评分与单独治疗组无显著差异（P＞0.05）。

2.2 IFN-α、1，25-（OH）2D3单独及联合应用治疗前后小鼠肝脏CoI1α1mRNA表达的变化

图1 各组小鼠肝脏组织HE染色结果 ×100Fig.1 HE staining of tissue slices from mice livers×100

图2 各组小鼠肝脏组织Masson染色结果 ×100Fig.2 Masson staining of tissue slices from mice livers×100

表1 各组小鼠肝纤维化评级及计分Tab.1 Histological grading and staging in CCL4-induced mice hepatic fibrosis specimens

应用实时PCR检测各实验小鼠肝脏内ECM的主要成分和纤维化形成的重要标志物CoI1α1 mRNA的表达水平。结果如图3所示：与正常对照组小鼠相比，盐水治疗组CoI1α1表达水平上升（P＜ 0.05）；IFN-α、1，25-（OH）2D3单独治疗组及联合治疗组CoI1α1表达水平较盐水治疗组显著下降（P＜0.05），联合治疗组与单独治疗组相比，CoI1α1表达水平无统计学差异。

2.3 IFN-α、1，25-（OH）2D3治疗前后肝脏相关细胞因子的变化

治疗6周后，分别应用实时定量PCR及ELISA方法对小鼠肝脏局部细胞因子IL-6、IL-10及TNF-α进行检测，结果如图4所示：IFN-α、1，25-（OH）2D3单独及联合治疗后，IL-6及TNF-α表达水平与盐水治疗组相比呈明显下降趋势（P＜0.05）；IFN-α和1，25-（OH）2D3联合治疗组IL-6水平较单独治疗组高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明联合治疗效果较单独治疗更差。IFN-α、1，25-（OH）2D3单独及联合治疗后，IL-10水平较生理盐水治疗组明显升高，但3组之间无统计学差异。

图3 各组小鼠肝脏CoI1α1mRNA表达水平Fig.3 Expression of CoI1α1 mRNA in the livers of different groups

图4 肝细胞培养上清炎性因子TNF-α浓度及IL-6和IL-10mRNA的表达Fig.4 Expression of I L-6，IL-10mRNA and TNF-α in the liver of different groups

2.4 IFN-α、1，25-（OH）2D3单独及联合治疗对TGF-β/Smad通路相关分子表达水平的影响

如图5所示：IFN-α和1，25-（OH）2D3单独治疗组肝脏组织培养上清中TGF-β浓度及肝脏Smad3 mRNA表达水平与生理盐水治疗组相比均明显下降（P＜0.05），但与联合治疗组相比则无统计学差异（P＞0.05）。联合治疗后虽然降低了TGF-β/Smad通路相关分子表达水平，但与两者单独治疗组相比并未见更好的阻断效果。

3 讨论

图5 各组小鼠肝脏组织培养上清TGF-β浓度及肝脏Smad3mRNA表达水平的变化Fig.5 Smad3mRNA and TGF-β expression level in the liver of different groups

肝纤维化是多种病因所致急性或慢性肝病共有的病理改变，具有可逆性。IFN-α和1，25-（OH）2D3均已被证实具有抗纤维化作用，且两者的作用机制存在交叉。CoI1α1是ECM的主要成分，大量产生的CoI1α1是纤维化疾病的共同病理特征。研究表明，IFN-α可抑制CCL4诱导的肝纤维化大鼠体内CoI1α1的表达，从而减轻ECM的过度增生［15］。1，25-（OH）2D3可通过VDR受体与胶原启动子序列近端Sp1.1及另一远端位点结合，抑制人星状细胞中CoI1α1的表达［16］。本研究结果显示：IFN-α和1，25-（OH）2D3治疗后，肝纤维化小鼠肝脏汇管区炎性浸润减轻，CoI1α1 mRNA表达水平显著降低；IFN-α和1，25-（OH）2D3单独或联合治疗均有抗肝脏纤维化的作用，且联合治疗并无叠加效应。

IL-6能通过介导炎性反应启动纤维化的形成，并可通过促进ECM的合成而促进肝纤维化的发生发展［17］。TNF-α可以促进肝内Ito细胞及纤维母细胞增殖，并促使其向肌纤维母细胞的转化。IL-10是一种抗炎性因子，能够拮抗炎性介质，抑制炎性反应。本研究通过观察IFN-α和1，25-（OH）2D3治疗前后IL-6、IL-10和TNF-α这3种细胞因子的变化，初步评判二者的治疗效果。结果显示：IFN-α和1，25-（OH）2D3单独或联合治疗后，小鼠肝脏内促炎性因子IL-6和TNF-α的表达水平均明显降低，IL-10则显著上升；且联合治疗并未更加有效地抑制促炎性细胞因子的产生，IL-6在联合治疗后较单独治疗的效果反而更差，提示二者联合治疗时可能会产生拮抗作用。

TGF-β/Smad3通路的活化可有效刺激肝纤维化形成，阻断该通路可能成为治疗肝纤维化的潜在靶点。在肝损伤时，TGF-β1主要由Kupffer和巨噬细胞释放，肝纤维化时则主要由HSC释放。TGF-β1是最强的致纤维化因子［18］，促进纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外基质合成与沉积。Smad3作为肝纤维化时细胞内主要信号传导介质，能将信号由胞质传递到胞核内，调控目的基因的表达，具有活化HSC、促进胶原合成等效应，是调控肝纤维化发生发展的重要因素。研究表明IFN-α和1，25-（OH）2D3可通过此通路抑制纤维化的发生发展［19］。本研究结果显示：IFN-α和1，25-（OH）2D3单独或联合治疗后，肝纤维化小鼠肝脏内TGF-β和Smad3的表达水平均下降，提示二者单独或联合治疗均有效果，但无叠加效应。

总之，本研究结果显示，1，25-（OH）2D3联合IFN-α治疗CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化效果与单独治疗效果相似。文献报道，对临床丙型肝炎基因4型患者进行干扰素治疗的同时，行维生素D3联合治疗并无显著效果［20］，与本研究结果一致。

［1］Su TH，Kao JH，Liu CJ.Molecular mechanism and treatment of viral hepatitis-related liver fibrosis［J］.Int J Mol Sci，2014，15（6）：10578-10604.

［2］Khanizadeh S，Ravanshad M，Hosseini S，et al.Blocking of SMAD4 expression by shRNA effectively inhibits fibrogenesis of human hepatic stellate cells［J］.Gastroenterol Hepatol Bed Bench，2015，8（4）：262-269.

［3］Song BJ，Rockey DC.Status of research on vitamin D supplementation in treating or preventing liver fibrosis［J］.Liver Int，2013，33（5）：653-655.

［4］Prietl B，Treiber G，Pieber TR，et al.Vitamin D and immune function［J］.Nutrients，2013，5（7）：2502-2521.

［5］Kim CS，Kim SW.Vitamin D and chronic kidney disease［J］.Korean J Intern Med，2014，29（4）：416-427.

［6］Tian Y，Lü G，Yang Y，et al.Effects of vitamin D on renal fibrosis in diabetic nephropathy model rats［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（6）：3028-3037.

［7］Zhang Y，Kong J，Deb DK，et al.Vitamin D receptor attenuates renal fibrosis by suppressing the renin-angiotensin system［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21（6）：966-973.

［8］Drapkina OM，Drapkina IS.Heart and liver fibrosis：the components of a single equation［J］.Kardiologiia，2014，54（9）：57-62.

［9］Seki E，Schwabe RF.Hepatic Inflammation and fibrosis：functional links and key pathways［J］.Hepatology，2015，61（3）：1066-1079.

［10］Feng L，Kang H，Liu LN，et al.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells contribute in liver fibrosis improvement with interferon alpha［J］.Inflammation，2013，36（6）：1374-1382.

［11］Pellicoro A，Ramachandran P，Iredale JP，et al.A liver fibrosis and repair：immune regulation of wound healing in a solid organ［J］. Nat Rev Immunol，2014，14（3）：181-194.

［12］Frei A，Zimmermann A，Weigand K.The N-terminal propeptide of collagen typeⅢin serum reflects activity and degree of fibrosis in patients with chronic liver disease［J］.Hepatology，1984，4（5）：830-834.

［13］Desmet VJ，Gerber M，Hoofnagle JH，et al.Classification of chronic hepatitis：diagnosis，grading and staging［J］.Hepatology，1994，19（6）：1513-1520.

［14］Chevallier M，Guerret S，Chosseqros P，et al.A histological semiquantitative scoring system for evaluation of hepatic fibrosis in needle liver biopsy specimens：comparison with morphometric studies［J］.Hepatology，1994，20（2）：349-355.

［15］Inaqaki Y，Nemoto T，Kushida M，et a1.Interferon alfa down-regulates collagen gene transcription and suppresses experimental hepatic fibrosis in mice［J］.Hepatology，2003，38（4）：890-899.

［16］Potter JJ，Liu X，Koteish A，et al.1，25-dihydroxyvitamin D3 and its nuclear receptor repress human a1（I）collagen expression and type I collagen formation［J］.Liver Int，2013，33（5）：677-686.

［17］O′Reilly S，Ciechomska M，Cant R，et al.Interleukin-6（IL-6）trans signaling drives a STAT3-dependent pathway that leads to hyperactive transforming growth factor-β（TGF-β）signaling promoting SMAD3 activation and fibrosis via gremlin protein［J］.J Biol Chem，2014，289（14）：9952-9960.

［18］Brew K，Nagase H.The tissue inhibitors of metalloproteinases（TIMPs）：an ancient family with structural and functional diversity［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1803（1）：55-71.

［19］Ding N，Yu RT，Subramaniam N，et al.A vitamin D receptor/ SMAD genomic circuit gates hepatic fibrotic response［J］.Cell，2013，153（3）：601-613.

［20］Esmat G，El Raziky M，Elsharkawy A，et al.Impact of vitamin D supplementation on sustained virological response in chronic hepatitis C genotype 4 patients treated by pegylated interferon/ribavirin［J］.J Interferon Cytokine Res，2015，35（1）：49-54.

（编辑 王又冬）

Efficacy of Activated Vitamin D3Combined with Interferon-α in the Treatment of CCL4-induced Hepatic Fibrosisin Mice

RONG Chen，KANG Hui，HAO Feng-tian，TAO Zhi-song

（Department of Clinical Laboratory，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the curative effect of activated vitamin D3combined with IFN-α on CCl4-induced hepatic fibrosis in BALB/c mouse model.MethodsThe experimental mice received 100 μL of 10%CCl4intraperitoneally to induce a model of hepatic fibrosis，and the normal control group were administrated with same volume of 0.9%saline（n=6）.The experimental mice then were randomly divided into four treatment groups and treated for six weeks：saline therapy group（0.9%saline，100 μL/mouse，n=6），IFN-α therapy group（IFN-α 800 U/mouse，n= 6），1，25-（OH）2D3therapy group（50μg/kg，by gavaged，n=6）and combined treatment therapy group（combined treatment，n=6）.Hepatic injury and hepatic pathology were examined by HE staining and Masson staining.Interleukin-6（IL-6），interleukin-10（IL-10），tumor necrosis factor α（TNF-α），transforming growth factor-β（TGF-β）and Smad3 were determined by real-time PCRand ELISA.ResultsInflammatory cell infiltration and periportal collagen deposition were significantly reduced in all the therapeutic group expect saline therapy group assessed by HE and Masson staining.The IFN-α therapy group，1，25-（OH）2D3therapy group and combined treatment therapy group displayed significant decrease in Col1α1，IL-6，TNF-α，TGF-β and Smad3 expression and increase in IL-10 expression in liver tissue（P＜0.05）.ConclusionThe effect of 1，25-（OH）2D3combined with IFN-α therapy is similar to separated treatment.

hepatic fibrosis；1，25-（OH）2D3；IFN-α

R575.2

A

0258-4646（2015）12-1110-06

高等学校博士学科点专项科研基金（21040988）

荣辰（1989-），女，技师，硕士.

康辉，E-mail：kanghui65@sina.com

2015-04-15

网络出版时间：