谷胱甘肽S转移酶基因多态性与特发性男性不育精子DNA完整性相关性的研究

王欢，孙发，邢俊平，丁上书，孙超，王新阳，邹铁军，唐开发，

（1.贵州医科大学电镜室，贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院泌尿外科，贵阳 550004；3.西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科，西安 710061；4.陕西省人民医院泌尿外科，西安 710068）

谷胱甘肽S转移酶基因多态性与特发性男性不育精子DNA完整性相关性的研究

王欢1，孙发2，邢俊平3，丁上书3，孙超2，王新阳3，邹铁军4，唐开发2，3

（1.贵州医科大学电镜室，贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院泌尿外科，贵阳 550004；3.西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科，西安 710061；4.陕西省人民医院泌尿外科，西安 710068）

目的探讨谷胱甘肽S转移酶基因M1、T1及P1（GSTM1、GSTT1及GSTP1）基因多态性与特发性男性不育症患者精子DNA断裂指数（DFI）的相关性。方法选择特发性少弱精子性男性不育症患者246例。采用聚合酶链反应及聚合酶链反应—限制性片段长度多态性方法，分别对GSTM1、GSTT1及GSTP1基因进行分型。采用吖啶橙染色标记流式细胞仪检测精子DNA完整性，并计算DFI。结果GSTT1基因缺失型组特发性少弱精子性男性不育症患者精子DFI显著高于野生型组（P＜0.01）；而GSTM1基因缺失型组与GSTP1基因突变型组患者精子DFI与野生型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论GSTT1基因缺失型与特发性男性不育症精子DFI呈正相关。

男性不育症；谷胱甘肽S转移酶；基因多态性；DNA断裂指数

男性不育症是指夫妇同居1年以上，未采取任何避孕措施，由于男性方面的原因导致女方不能受孕者［1］。男性不育症患者中有30%的患者未发现明确的致病原因，发病机制及病理生理过程均不清楚，故称之为特发性男性不育症［2］。研究表明，精子DNA完整性比常规的精液分析能更准确地预测男性的生育能力，且不育症男性中精子DNA损伤程度明显高于正常生育的男性，精子DNA损伤可能是男性不育症的负相关因素［3，4］。然而，精子DNA损伤的机制到目前尚不清楚。研究认为，环境因素（如活性氧）、遗传因素及凋亡是导致精子DNA损伤的主要因素［5］。

谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是一组具有解毒功能的蛋白超基因家族，属于机体Ⅱ相解毒酶系统，其中编码Mu、Theta和Pi亚型酶的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因在人群中存在功能性基因遗传多态性［6］。本研究拟探讨GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多态性与特发性男性不育症患者精子DNA完整性的相关性，旨在为男性不育症的发病机制及病理生理过程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：按WHO第4版标准，常规进行精液分析≥2次，结果符合以下标准者纳入研究：睾丸体积在中国成人睾丸正常体积范围内（15～25 mL）；精液量≥2.0 mL，精子密度＞5×106/mL～＜20×106/mL，A级精子百分率＜25%，且（A+B）级精子百分率＜50%；血清性激素水平在正常范围内；有规律性生活1年以上，未采取任何避孕措施而女方未受孕。排除标准：性生活异常及具有可能影响精液分析参数的因素。通过以上纳入及排除标准，共有246例患者纳入研究。

1.1.2 主要试剂及仪器：全血基因组提取试剂盒（美国Axygen biosciences公司），2×PCR Mixture（立陶宛MBI公司）；Biomltra梯度PCR仪（德国Sigma公司），凝胶成像分析系统（美国BioRad公司），流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和合成：根据基因序列，设计PCR扩增引物GSTM1：Forward 5′-GAACTCCCTGAAAAG CTAAAGC-3′，Reverse 5′-GTTGGGCTCAAATATAC GGTGG-3′，扩增产物长度219 bp；GSTT1：Forward 5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′，Reverse 5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′，扩增产物长度480 bp；GSTP1：Forward 5′-ACCCCAGGGCTCTATG GGAA-3′，Reverse 5′-TGAGGGCACAAGAAGCCC CT-3′，扩增产物长度177 bp；内参照β-actin引物序列为：Forward 5′-ACTCCCCATCCCAAGACC-3′，Reverse 5′-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′，扩增产物长度为400 bp［8］。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2 外周血标本采集和基因组DNA提取：采取患者外周静脉血3 mL，以乙二胺四乙酸二钠作为抗凝剂混匀为抗凝血液，置于-80℃冰箱备用。基因组DNA提取按照外周血微量基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，所提取DNA置于-20℃冰箱备用。

1.2.3 精液标本的收集及处理：所有研究对象禁欲3～5 d，用手淫、取精仪或体外排精法收集一次排精的全部精液，留于清洁收集器皿内，标明具体采集时间，置37℃培养箱内，待液化后备用。

1.2.4 GSTs基因型PCR扩增：采用Biomltra梯度PCR仪对所有DNA标本进行GSTM1、GSTT1和GSTP1基因型检测。反应体系为25 μL（2×PCR Mixture 12.5 μL，双蒸水8.5 μL，1.0 μmol/L引物各0.5 μL，100 μg/μL DNA模板2 μL）。PCR扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统进行检测。所有样本均重复3次PCR扩增及电泳检测。GSTP1基因PCR扩增产物采用BsmAI（ALW26I）限制性内切酶进行处理。

1.2.5 精子DNA断裂指数（DNA fragmentation index，DFI）检测：精液标本完全液化后，于冰上用TNE缓冲液（0.15 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl，0.001 mol/L Na2EDTA，pH7.4，4℃），悬浮精子至（1～2）×106/ mL；对稀释好的精液标本进行酸性裂解（0.08 mol/L HCl，0.15 mol/L NaCl，0.1%Triton-X 100，pH1.2，4℃）；加入吖啶橙染液（6 μg/mL吖啶橙，0.037 mol/L柠 檬 酸 ，0.126 mol/L Na2HPO4，0.001 1 mol/L Na2EDTA，0.15 mol/L NaCl，pH6.0，4℃）；收集细胞并重新悬浮细胞；流式细胞仪检测，488 nm激发光，单链DNA为红色，双链DNA为绿色。精子DFI= red/（red+green）×100%。重复检测DFI 3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 精子染色质结构分析

精子吖啶橙染色荧光显微镜下所见及精子染色质结构分析流式细胞仪检测结果见图1、2。

2.2 GSTM1、GSTT1和GSTP1基因型鉴定

GSTM1基因扩增产物长度为219 bp，GSTT1基因扩增产物为480 bp，GSTP1基因扩增产物为177 bp，经BsmAI（ALW26I）限制性内切酶酶切后，野生型产物为177 bp，突变纯合型后产物为87 bp及90 bp，突变杂合型产物为177 bp、87 bp及90 bp，β-actin内参照扩增产物为400 bp。见图3、4。

2.3 GSTs基因多态性与精子DFI的相关性

图1 精子吖啶橙染色荧光显微镜观察 ×40Fig.1 The sperms stained by acridine orange was observed under fluorescence microscopy×40

图2 精子染色质结构分析流式细胞仪检测Fig.2 Sperm chromatin structure assay detected by flow cytometry

图3 GSTM1、GSTT1和GSTP1基因遗传多态性水平凝胶电泳图Fig.3 Gel electrophoresis for glutathione S-transferase M1 and T1 gene polymorphism

图4 GSTP1基因扩增产物BsmAI酶切后水平凝胶电泳图Fig.4 Gel electrophoresis for GSTP1 gene amplification products digestion by BsmAI enzyme

结果显示：GSTM1（-）基因型亚组患者精子DFI与GSTM1（+）基因型亚组相比较，差异无统计学意义（P=0.063）；GSTT1（-）基因型亚组精子DFI明显高于GSTT1（+）基因型亚组，差异有统计学意义（P＜0.01）；GSTM1/T1（-/-）基因型亚组精子DFI显著高于GSTM1/T1（+/+）基因型亚组，差异有统计学意义（P＜0.01）；GSTP1（A/G+G/G）基因型亚组精子DFI与GSTP1（A/A）基因型亚组相比较，无统计学差异（P=0.347）。见表1。

3 讨论

精液质量是评价男性生殖能力的基础，为男性不育的诊断、治疗及预后提供了重要的辅助信息。临床上常常采用精液分析（包括pH值，精子密度、活力及形态）来评估男性的生殖能力［9］。然而，约15%的男性不育症患者精液分析结果在正常范围内，因此，对男性不育症患者精子质量的评估往往不能仅依据精液分析［10］。研究发现，男性不育症患者精子DNA损伤明显高于生育的男性，高水平的精子DNA损伤，如精子数量、活力降低，正常形态精子减少，往往与较差的精液分析参数相关。精子DNA损伤也影响卵细胞浆内精子注射技术的成效［3，11］。因此，精子DNA损伤可能是导致男性不育的重要危险因素之一。

目前，导致精子DNA损伤的原因尚不清楚。研究认为，人类精子染色体在其组蛋白被鱼精蛋白代替的过程中经历了1次重要的重构，需要染色体组蛋白的乙酰化以及DNA拓扑异构酶Ⅱ，通过解旋DNA双螺旋结构形成1个临时的环，如果这些环没有被修复，即形成了DNA碎片［12～14］。研究表明，精子DNA损伤与高水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS）存在密切关系［15］。体内低水平ROS在精子成熟及功能（如精子获能和顶体反应）中扮演着重要的角色。同时，精浆中的抗氧化物质可以保护精子DNA免受氧化损伤，而过多的ROS则会导致细胞和DNA损伤［16，17］。

GSTs是一组具有解毒功能的蛋白超基因家族，属于机体Ⅱ相解毒酶系统，参与细胞对外源性化学物质、人工合成有机物质、ROS及其代谢产物解毒的各个生理阶段［7］。前期研究发现GSTM1、T1基因缺失型精索静脉曲张患者精子DNA完整性显著低于其野生型［7］。本研究采用吖啶橙染色及流式细胞仪技术对特发性男性不育症患者精子DFI进行检测分析，同时对其GSTs基因多态性进行分型，结果发现GSTT1基因缺失型组精子DFI显著高于野生型组，而GSTM1、P1基因多态性未发现与精子DFI存在相关性。本研究结果仍有待于多中心、大样本进一步研究。

表1 特发性男性不育症患者各GSTs基因型亚组精子DFI的比较Tab.1 Comparison of sperm DFI in each GSTs genotype of the patients with idiopathic male infertility

［1］World Health Organization.WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple［M］.Cambridge：Cambridge University Press，2000.

［2］Pasqualotto FF，Pasqualotto EB，Sobreiro BP，et al.Clinical diagnosis in men undergoing infertility investigation in a university hospital［J］.Urol Int，2006，76（2）：122-125.

［3］Evgeni E，Charalabopoulos K，Asimakopoulos B.Human sperm DNA fragmentation and its correlation with conventional semen parameters［J］.J Reprod Infertil，2014，15（1）：2-14.

［4］Lewis SE，John AR，Conner SJ，et al.The impact of sperm DNA damage in assisted conception and beyond：recent advances in diagnosis and treatment［J］.Reprod Biomed Online，2013，27（4）：325-337.

［5］Komiya A，Kato T，Kawauchi Y，et al.Clinical factors associated with sperm DNA fragmentation in male patients with infertility［J］. Scientific World Journal，2014；2014：868303.

［6］Jiang S，Yu L，Cheng J，et al.Genomic damages in peripheral blood lymphocytes and association with polymorphisms of three glutathione S-transferases in workers exposed to formaldehyde［J］.Mutat Res，2010，695（12）：9-15.

［7］Tang K，Xue W，Xing Y，et al.Genetic polymorphisms of glutathione s-transferase M1，T1，and P1，and the assessment of oxidative damage in infertile men with varicoceles from northwestern china［J］.J Androl，2012，33（2）：257-263.

［8］World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination of human Bsmen and sperm-cervical mucus interaction［M］. 4th ed.Cambridge：Cambridge University Press，1999.

［9］Agarwal A，Allamaneni SS.Sperm DNA damage assessment：a test whose time has come［J］.Fertil Steril，2005，84（4）：850-853.

［10］Fraczek M，Szumala-Kakol A，Dworacki G，et al.In vitro reconstruction of inflammatory reaction in human semen：effect on sperm DNA fragmentation［J］.J Reprod Immunol，2013，100（1）：76-85.

［11］Pankotai T，Bonhomme C，Chen D，et al.DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase Ⅱ transcription in the presence of DNA breaks［J］.Nat Struct Mol Biol，2012，19（3）：276-282.

［12］Lagerwerf S，Vrouwe MG，Overmeer RM，et al.DNA damage response and transcription［J］.DNA Repair（Amst），2011，10（7）：743-750.

［13］Nabi A，Khalili MA，Halvaei I，et al.Prolonged incubation of processed human spermatozoa will increase DNA fragmentation［J］. Andrologia，2014，46（4）：374-379.

［14］De Iuliis GN，Thomson LK，Mitchell LA，et al.DNA damage in human spermatozoa is highly correlated with the efficiency of chromatin remodeling and the formation of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，a marker of oxidative stress［J］.Biol Reprod，2009，81（3）：517-524.

［15］Guz J，Gackowski D，Foksinski M，et al.Comparison of oxidative stress/DNA damage in semen and blood of fertile and infertile men［J］.PLoS One，2013，8（7）：e68490.

［16］Aitken RJ，Smith TB，Jobling MS，et al.Oxidative stress and male reproductive health［J］.Asian J Androl，2014，16（1）：31-38.

［17］Hayes JD，Flanagan JU，Jowsey IR.Glutathione transferases［J］. Annu Rev Pharmacol Toxicol，2005，45（1）：51-88.

（编辑 王又冬）

Correlation between Glutathione S-transferase Polymorphisms and Sperm DNA Integrity in Male Patients with Idiopathic Infertile

WANG Huan1，SUN Fa2，XING Jun-ping3，DING Shang-shu3，SUN Chao2，WANG Xin-yang3，ZOU Tie-jun4，TANG Kai-fa2，3

（1.Electron Microscope Lab of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；2.Department of Urology，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of Medical College of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；4.Department ofUrology，ShanxiPeople′s Hospital，Xi′an 710068，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between glutathione S-transferase gene M1，T1 and P1（GSTM1，GSTT1and GSTP1）polymorphism and sperm DNA fragmentation index（DFI）in male patients with idiopathic infertile.MethodsThe study included 246 male patients with idiopathic infertility.Polymerase chain reaction（PCR）and polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）were used to identify the genotype of GSTM1，GSTT1and GSTP1，respectively.Sperm DFI was analyzed by flow cytometry with acridine orange staining.ResultsThe sperm DFI was significantly higher in GSTT1 gene null type group than in GSTT1gene wild type group（P＜0.01）；and there were no significant differences in GSTM1and GSTP1gene mutation type groups when comparing with the wild type group（P＞0.05）.ConclusionGSTT1gene deletion was positive associated with the sperm DFI in male idiopathic infertile patients.

male infertility；glutathione S-transferase；polymorphism；DNA fragmentation index

R698+.2

A

0258-4646（2015）12-1075-04

国家自然科学基金（81300541）；贵州省科学技术基金计划项目{黔科合J字［2012］2054号}；贵阳医学院附属医院博士基金（C-2012-6）

王欢（1977-），男，讲师，硕士.

唐开发，E-mail：doc.tangkf@hotmail.com

2014-12-01

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