原发性舍格伦综合征患者Th22细胞及其细胞因子IL-22的表达及意义

王天祥，李金龙，柳洪志，王秋旭

（1.大庆油田总医院口腔颌面外科，黑龙江 大庆 163001；2.佳木斯大学口腔医学院口腔颌面外科，黑龙江 佳木斯 154002；3.中国医科大学附属盛京医院口腔科，沈阳 110004）

原发性舍格伦综合征患者Th22细胞及其细胞因子IL-22的表达及意义

王天祥1，李金龙2，柳洪志1，王秋旭3

（1.大庆油田总医院口腔颌面外科，黑龙江 大庆 163001；2.佳木斯大学口腔医学院口腔颌面外科，黑龙江 佳木斯 154002；3.中国医科大学附属盛京医院口腔科，沈阳 110004）

目的探讨Th22细胞及其细胞因子白细胞介素22（IL-22）在原发性舍格伦综合征（pSS）患者外周血中的表达及临床意义。方法pSS患者根据唾液腺受累程度分为轻、中、重度患者。健康成人作为对照组。检测Th22细胞及其细胞因子IL-22在轻、中、重度pSS患者和健康对照组外周血中的表达。结果pSS患者外周血中Th22细胞及细胞因子IL-22表达明显高于健康对照组（P＜0.05）。而且患者病情越严重，外周血中Th22细胞及细胞因子IL-22水平越高：重度组高于中度组（P＜0.05），中度组高于轻度组（P＜0.05）。结论pSS患者外周血中Th22及其细胞因子IL-22较健康对照组明显升高，而且病情越严重，Th22及其细胞因子IL-22水平越高。因此，检测外周血中Th22及其细胞因子IL-22水平有可能成为判断pSS病情严重程度的指标，并为治疗提供新的治疗靶点。

原发性舍格伦综合征；Th22；IL-22

原发性舍格伦综合征（primary Sjögren′s syndrome，pSS）是外分泌腺进行性破坏导致黏膜及结膜干燥的一种自身免疫性疾病［1］。临床表现为长时间的口腔及眼部黏膜干燥、腮腺及其他外分泌腺体肿大，严重的甚至可累及神经系统等多个系统和脏器。本研究旨在明确健康人群及不同病变程度的pSS患者外周血中Th22及其细胞因子白细胞介素22（interlukin-22，IL-22）的表达情况，为pSS的诊断及治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2012年9月至2014年12月于大庆市油田总医院口腔科及风湿免疫科确诊pSS患者共90例。男性32例，女性58例；年龄22～75岁，其中22～＜40岁14例，40～＜60岁59例，≥60岁17例。均符合pSS修订诊断标准。对照组18例，均来自健康献血者，且无自身免疫病史。

1.2 纳入标准

采用2002年国际诊断分类标准［2］，诊断项目包括：（1）口腔症状；（2）眼部症状；（3）眼部体征；（4）组织学检查；（5）涎腺受损；（6）抗SSA/SSB抗体（+）。其中有4项指标提示阳性，即可诊断为pSS。

1.3 方法

1.3.1 分组：通过锝腮腺动态显像检测将pSS患者分为轻、中、重3组，见表1。患者取仰卧位，静脉注射99m锝（99mTcO4-）185 MBq（5mCi），注射后用配有低能平行孔准直器SPECT（单光子发射器计算机断层）进行唾液腺动、静态显像，放大倍数1∶1.6，以1帧/min速度连续采集40帧，第30分时给患者口含VitC粉300 mg，第40分时分别左、右侧位和正位唾液腺显像，将所得结果应用计算机ROI程序（感兴趣区）进行定量分析。

表1 99m锝动态显像检测将pSS患者分为轻、中、重3组Tab.1 The pSS patients were divided into mild，moderate and severe groups according to the 99mTc scintigraphy analysis

图1 Th22、Th17在pSS和健康人外周血中的表达Fig.1 Th22 and Th17 expression in peripheral blood of pSS and healthy individuals

1.3.2 分离及培养外周血单个核细胞：取外周血，去血浆，用淋巴分离液分离出人外周血单核细胞层，分离出的液体可形成4层，自上而下依次是血浆和组织匀浆液层、环状乳白色淋巴细胞或单核细胞层、透明分离液层和红细胞层。小心取出中间白膜层（单核细胞层），即为PBMC层。然后将PBMC接种到培养板里孵育4 h。

1.3.3 流式检测：将孵育好的PBMC培养板内的细胞制悬液，分别移至流式管中，分别加入4 μL CD4-PerCP，后分别固定剂、破膜剂，再分别加入1 μL IL-17-Alexa-Flour，IL-22-PE室温孵育30 min，将染色后的细胞群通过前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光信号进行设门，并用Flowjo 7.6.1软件分析各细胞亚群的比例。

1.3.4 ELISA法检测pSS实验组和对照组血清中IL-22的表达：抽取患者外周血2 mL，加入EDTA抗凝，通过离心方法取得上部分血清后冻存（-20℃），ELISA法（按试剂盒说明书操作）检测实验组和对照组血清中的IL-22水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行正态性检验，实验数据呈正态分布，用描述，并进行两独立样本t检验；PASI评分呈偏态分布，应用Spearman法进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测外周血Th22、Th17细胞的水平结果

外周血Th22比对照组健康人显著升高（P＜0.01）。不仅如此，我们还发现随着病情的加重，Th22细胞频率逐渐升高（P＜0.01），而Th17细胞的表达在轻、中、重3组之间无明显差异（P＞0.05），见图1。

2.2 ELISA法检测结果

血清中IL-22的浓度结果见表2，pSS患者血清中IL-22的浓度显著高于对照组（P＜0.05），且随着病情的加重，IL-22的浓度逐渐增多。

表2 不同组别中IL-22水平的比较Tab.2 Comparison of the levels of IL-22 in different groups

2.3 Th22细胞频率与细胞因子IL-22浓度的相关性结果

pSS患者血清中IL-22的浓度与Th22细胞比率呈正相关（R=0.375，P=0.022 3），见图2。

图2 Th22和IL-22的相关性Fig.2 The relationship between Th22 and IL-22

3 讨论

pSS的发生可以分为3个连续的阶段：第一阶段是起始期，一系列异常的基因、生理和生化因素导致涎腺细胞新生减少和凋亡增加［3］，此阶段尚不能检测到明显的自身免疫反应；第二阶段是确立期，腺上皮细胞的凋亡引发了自身免疫反应，白细胞浸润并表达致炎因子，形成淋巴滤泡，滤泡中开始是以T细胞为主，后来B细胞增多，并出现自身免疫抗体［4］；第三阶段是临床期，开始表现出各种临床症状，涎腺和泪腺分泌功能障碍。由于pSS发病机制的复杂性，很多学者针对T淋巴细胞的各种亚型在发病过程中所发挥的作用分别进行了研究，已经证实了T辅助淋巴细胞中的Th1细胞和Th2细胞与pSS的发病密切相关，而Treg/Th17之间的动态平衡可以影响免疫系统的反应模式［5］。

Th22细胞是一群新型CD4+辅助T细胞，它相对独立于Th1、Th2及Th17细胞，是一种CD4+效应T细胞亚群，源于Th0细胞。Eyerich等［6］应用免疫学等方法进行研究，结果表明Th22不仅有不同于其他T细胞的生长和分化的调节机制，而且具有特殊的信息传导方式和稳定的效应因子，更特殊的是Th22的基因编码的蛋白和趋化因子与组织的重塑和新血管的生成有密切的关系。所以Th22是一群独立的有特殊功能的辅助T细胞亚群。在某种特定的条件下，一部分Th22细胞可以转化成为其他效应的T细胞亚群。Th22细胞可以表达CCR4、CCR6和CCRl0。T细胞亚群是一个多样化的细胞群，它包括Th1、Th9、Th17等，这些T细胞间存在着一种相互促进相互制约的复杂的调控机制，这是一种非常复杂的平衡，Th22细胞是T细胞亚群中的新成员，对于它的研究还很少，自身免疫性疾病病理机制以及治疗等的研究可以通过深入对Th22细胞的生长、分化、生理、病理以及与其他T细胞之间的调控关系的研究，得到新的启发，对于一些自身免疫疾病的治疗也具有重要的意义。随着对Th22研究的不断加深，越来越多的研究表明，Th22及其细胞因子IL-22在皮肤、肿瘤、自身免疫等疾病中起着举足轻重的作用。

Th22细胞产生IL-22，不产生IL-4、IL-17和IFN-γ。近期有研究［7］认为Th22细胞是IL-22的重要来源，且本实验的实验结果看到二者具有的正相关关系也证明了这一点。IL-22是一种新颖的免疫介质，由免疫细胞产生，却不影响这些细胞，而是调节特定组织细胞的功能［8］。有研究［9］发现在克罗恩氏病患者的外周血中也存在大量的IL-22，并且IL-22的血清水平和疾病的活动性呈正相关。IL-22在类风湿性关节炎中的表达也有描述，在类风湿性关节炎的研究中［10］，滑液组织中IL-22及外周血中IL-22+ CD4+细胞的表达明显增加。总之，IL-22可以使组织细胞的固有免疫反应得到增强，而且还具有保护组织受损及增强组织再生等功能。

近年来Th22细胞及其细胞因子IL-22在自身免疫性疾病中的作用成为新的研究热点，本实验检测了Th22细胞及其细胞因子IL-22在健康者、腺体破坏轻、中、重3种程度的pSS患者外周血中的表达变化，图1结果显示患者外周血Th22细胞频率比对照组健康人显著升高（P＜0.000 2）。不仅如此，我们还发现随着病情的加重，Th22细胞频率逐渐升高（P＜0.000 1），而Th17细胞的表达在轻、中、重3组之间无显著性差异（P＞0.05）。对照组Th17和Th22细胞水平分别为0.825%和0.672%（图1A）；pSS轻度组Th17和Th22细胞水平分别为0.893%和2.754%（图1B）；pSS中度组Th17和Th22细胞水平分别为0.979%和3.087%（图1C）；pSS重度组Th17和Th22细胞水平分别为0.899%和7.749%（图1D）。表2表明患者血清中IL-22的浓度显著高于对照组（P=0.031 0），且随着病情的加重，IL-22的浓度逐渐增多。实验还发现pSS患者血清中IL-22的浓度与 Th22细胞比率呈正相关（r=0.325，P= 0.022 3，图2）。深入研究Th22细胞和IL-22在不同程度患者中外周血中的表达，明确其相关性，可能为揭示pSS的发病机制及治疗提供新的依据，有利于开发新的免疫调节药物。由实验结果推断，通过对pSS患者Th22细胞的活性进行调节或者通过一些手段阻断IL-22的效应通路，可能会延缓pSS患者病情发展，为pSS的治疗提供新的方向。

［1］孔令华，严春雷，潘颖.干燥综合征54例唾液腺核素显像定量分析与高频超声及唇腺活检对比研究［J］.交通医学，2011，25（2）：133-136.

［2］Vitali C，Bombardieri S，Jonsson R，et al.Classification criteria for Sjögren′s syndrome：a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group［J］.Ann Rheum Dis，2002，61（6）：554-558.

［3］贾志宇，张英怀.细胞凋亡在Sjögren′s综合征中的作用［J］.国外医学口腔学分册，2003，30（2）：132-134.

［4］刘浩，姜广水.Th17细胞在舍格伦综合征发病中的作用［J］.国际口腔医学杂志，2010，37（6）：4-8.

［5］Van Amelsfort J M，Jacobs KM，Bijlsma JW，et al.CD4+CD25+regulatory T cells in rheumatoid arthritis：differences in the presence，phenotype，and function between peripheral blood and synovial fluid［J］.Arthritis Rheum，2004，50（9）：2775-2785.

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（编辑 裘孝琦）

Clinical Significance of IL-22 Expression and Percentage of IL-22-producing Th22 Cellsin Primary Sjögren′s Syndrome

WANG Tian-xiang1，LIJin-long2，LIU Hong-zhi1，WANG Qiu-xu3

（1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Daqing Oilfield General Hospital，Daqing 163001，China；2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Affiliated Stomatology Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China；3.Department of Stomatology Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo measure the percentage of Th22 cells and evaluate the levels of plasma interlukin-22（IL-22）in human peripheral blood，so as to determine their clinical significance in primary Sjögren′s syndrome（pSS）.MethodsPatients with pSS were divided into three subgroups based on severity of labial gland involvement：mild，moderate and severe.Healthy people served as controls.The percentage of Th22 cells and the levels of IL-22 in human peripheral blood from pSS patients and healthy controls were measured and compared.ResultsCompared to healthy controls，pSS patients had significantly higher percentage of Th22 cells and higher plasma IL-22 levels（P＜0.05）.Among pSS patients，the more serious illness they had，the higher percentage of Th22 cell and levels of IL-22 were observed.Severe patients had higher percentage of Th22 cells and IL -22 levels than moderate patients（P＜0.05），and moderate patients had higher percentage of Th22 cells and IL-22 levels than mild patients（P＜0.05）.ConclusionIncreased peripheral IL-22-secreting Th22 cells are detected in primary Sjögren′s syndrome，which have a close association with disease severity.These data suggest that Th22 and its released cytokine IL-22 may be considered as potential valuable biomarkers for severity of pSS，which may provide a novel therapeutic target for treatment.

primary Sjögren′s syndrome；Th22；IL-22

R782.7

A

0258-4646（2015）12-

辽宁省科学技术计划（2011010215-404）

王天祥（1976-），男，副主任医师，硕士.

王秋旭，E-mail：wangqx@sj-hospital.org

2015-03-30

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