MDMX与CK1α对p53抑癌蛋白调节机制的研究进展

魏玺，张晟，高明

MDMX与CK1α对p53抑癌蛋白调节机制的研究进展

魏玺1，张晟1，高明2△

作为抑癌蛋白，p53参与了细胞内多种信号转导过程，并在细胞周期调控、细胞凋亡及衰老等过程中发挥了重要的作用。鼠双微基因（murine double minute，MDM）2和MDMX（又称MDM4，murine double minute 4）是p53两个重要的调控因子。其中，MDMX能够通过与p53蛋白的相互作用以及转录后修饰来调节p53蛋白功能。虽然MDMX与MDM2蛋白结构同源，但是由于MDMX缺少E3连接酶，因此无法介导p53蛋白的降解。然而，MDMX本身能够通过分子内部结构的折叠与展开，与p53蛋白相互作用后调节其活性。在该过程中，MDMX的主要分子伴侣——CK1α（casein kinase 1 alpha）通过磷酸化MDMX并干扰其分子内部结合，从而协同调节p53蛋白。因而，MDMX及CK1α对p53蛋白的调节是一个多步骤、多因素参与的复杂过程。本文拟就MDMX以及CK1α对p53蛋白的具体调节机制进行综述。

肿瘤抑制蛋白质p53；酪蛋白激酶1α；p53蛋白；MDMX

p53作为一种重要的抑癌蛋白，在抑制肿瘤发生与发展中发挥着重要作用。p53的丢失或是突变能够增加癌症发生概率并导致恶性肿瘤进展［1］。p53作为一个重要的转录因子，在细胞周期调控、衰老及凋亡等过程中发挥很重要的作用［2-4］。在正常生理条件下，鼠双微基因4（MDMX，又称MDM4，murine double minute 4）是p53的关键调节蛋白，而酪蛋白激酶（casein kinase，CK）1α又是MDMX重要的分子伴侣。本文主要就MDMX以及CK1α对p53蛋白的调节机制综述如下。

1 MDMX对p53蛋白的调节机制

MDMX及鼠双微基因2（murine double minute 2，MDM2）是p53的2个重要的调节蛋白，控制着p53蛋白的表达及转录活化。当p53被DNA损伤信号活化时，磷酸化的p53、MDM2及MDMX能够协同、快速地出现反应。MDM2是一种经典的p53转录活化靶点，能够形成一种负反馈调节机制［5］。虽然MDMX缺少稳定的E3连接酶激活机制，但是其在调节p53转录活性方面仍占主要地位［6］。动物实验证明，在DNA损伤过程中，MDMX表达或者磷酸化是被共济失调毛细血管扩张症致病基因/细胞周期检查点激酶2（ATM/ Chk2）路径所活化。MDMX蛋白表达水平也能够被应激水平下MDM2介导的泛素化激活。同时，MDMX的C端位点在DNA损伤后出现降解，而其中的2个磷酸化位点S342及S367分别被Chk2和ATM所活化［7］。

1996年MDMX第一次被鉴定出来，后来证实为MDM2的同源结合蛋白。MDMX结构上与MDM2相似，与MDM2 C端RING结构域形成异二聚体，加强了MDM2对于p53的泛素化降解能力［8-9］。另外，MDM2能够泛素化并降解MDMX，最终产生相对稳定的MDM2、MDMX及p53蛋白［10-11］。MD⁃MX过表达能够在多数表达野生型p53的肿瘤以及肿瘤细胞系出现。有研究显示208例脑胶质瘤患者中有5例出现MDMX扩增及过表达［12］。最近研究发现MDMX在视网膜母细胞瘤中出现扩增及过表达［13-14］。近30%的肿瘤细胞监测中，MDMX不仅过表达而且转录增加，总的来说这些表现与p53野生型的表现有关。另一项研究显示，一系列肿瘤如乳腺癌、大肠癌及肺癌中会出现MDMX的过表达［15］。所有病例中，MDMX的过表达与p53野生型相关，并缺乏MDM2的扩增［15-16］。另外，MDMX过表达也能够阻止Ras诱导的细胞成熟前凋亡，以及MDMX能够与Ras相配合转化细胞，使其在裸鼠中形成肿瘤。总之，MDMX能够抑制p53活性，并且减少突变体引起的活性消失从而促进肿瘤的发生［15］。

MDMX转录后修饰包括磷酸化、泛素化及乙酰化。其中，被MDM2泛素化的MDMX是最早记录的MDMX转录后修饰［17-18］。MDM2的RING结构域被认为是与MDMX相互作用以及提供E3连接酶功能。这个作用被可变阅读框（alter⁃nate reading frame，ARF）以及DNA损伤所刺激，并与MDM2的ARF功能相关。有意思的是，ARF抑制了MDM2 E3连接酶的降解活性作用，并促进p53和MDM2这2个蛋白的稳定。换句话说，ARF被认为是促进MDM2依赖的MDMX降解。这也说明，p53被ARF激活后，增强MDMX的降解以及减少p53的泛素化［19］。另外，核小体应激反应也能够通过L11-MDM2相互作用以及原癌基因损伤，进一步降解MDMX蛋白［20］。MDMX对于p53的生理功能的重要性已被MDMX敲除小鼠的致死性所证实，然而这种致死性可以被协同敲除p53基因所反转［21］。

对于MDMX活性的最初报道是p53内源性目的基因导致的异位表达抑制了p53诱导转录活性［2］。这个作用依赖于p53-MDMX之间的结合域。p53的转录活性区域是MDMX/ p53以及MDM2/p53之间的相互作用所必需的［15］。这表明MDMX能够抑制p53转录活性，而这种作用是通过干扰p53结合于目的基因的启动子来实现的。

MDMX通过MDM2的RING结构域与MDM2结合并影响p53与MDM2的稳定性。一项研究显示MDMX通过干扰MDM2的自身泛素化从而稳定MDM2不被降解［22］。另一项研究显示，通过siRNA敲除MDMX能够降低MDM2水平，而增加了p53蛋白的表达［23］。有研究在U20S和MCF-7细胞系中应用siRNA敲除MDMX后，增加了MDM2和p53的蛋白表达水平［24］。而另一研究显示将MCF-7细胞系中敲除MDMX，并不影响MDM2或p53的蛋白水平［15］。其他研究发现，MDMX水平的增高能够通过防止MDM2的降解及MDM2依赖的泛素化，从而稳定p53蛋白［6］。这种作用被认为是降低MDM2诱导的p53核内输出以及有效降解p53蛋白的结果。

以上研究结果的分歧之处在于MDMX和MDM2的比例是否能够决定p53的总体效果。如果MDMX与MDM2的比例接近1∶1，p53决定MDM2依赖的蛋白降解；若MDMX表达水平高于MDM2，MDMX抑制MDM2介导的p53降解。进一步讲，MDMX水平增高，MDM2和MDMX竞争结合p53，MDM2有可能被MDMX所取代。在这种情况下，MDMX抑制p53的转录活性，而不依赖于MDM2［25］。

免疫荧光实验研究间接显示内源性MDMX位于细胞质内，而当MDM2共表达时则刺激MDMX向核内聚集。同时，

这个作用不依赖于p53，但是需要MDMX与MDM2蛋白的RING结构域作用以及MDM2的核定位信号系统［6］。另有研究报道p53能够不依赖于MDM2而将MDMX引入核内。然而，需要注意的是MDMX引入核内能够发生在p53/MDM2缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryo fibroblast，MEFs）的DNA损伤之后［23］。这表明MDMX细胞核内定位机制不依赖于MDM2和p53［26］。重要的是，后来发现Chk2介导的MDMX S367磷酸化以及MDMX与14-3-3结合后，能够暴露隐藏的核定位信号并诱导MDMX进入核内，进而调控p53蛋白功能［27］。

Chen等［28］研究显示，应用蛋白片段释放实验（proteolytic fragment release，PFR）解析MDMX分子内结构的相互作用，实验发现了MDMX分子内部相互作用以及其自动抑制作用机制：MDMX通过分子自身结构折叠与展开，与p53蛋白相互结合，从而发挥其调节p53蛋白作用。在这个过程中，MDMX依靠p53结合域与p53蛋白的N端初始结合后，酸性结构域（Acidic Domain）与RING结构域二次作用于p53蛋白的核心结构域，从而抑制p53与DNA结合。也有作者在小鼠模型中点突变或者截去MDMX的RING结构域后，发现p53蛋白活性发生改变以及小鼠胚胎发生死亡［29-30］。综上，MDMX对于p53蛋白的调控作用是一个多步骤相互作用、多因素相互影响的复杂过程。

2 CK1α协同MDMX对p53蛋白的调节机制

分子生物实验显示，MDMX通过与MDM2形成异聚体从而调节p53的降解［8-9］。动物实验显示，小鼠敲除MDMX后导致p53活性的增强［21］。然而，MDMX怎样通抑制p53蛋白还没有被明确阐述。MDMX纯化后发现CK1α和14-3-3是2个主要的结合蛋白。MDMX-14-3-3相互作用首先通过MDMX 367位点的磷酸化，而后MDMX核输入后的泛素化作用所激活。另一重要结合蛋白CK1α则与MDMX中间结构域相结合，包括酸性结构域和锌指结构。其中，RING锌指结构是位于MDMX相对保守的序列区域，也是MDMXMDM2形成异二聚体以及MDMX与CK1α相互作用的主要结构。而CK1α发挥作用是需要在MDMX进一步磷酸化的基础上来实现的［31］。

MDMX磷酸化直接作用于p53活性及MDMX降解。DNA损伤之后的MDMX有效降解取决于Chk2的S342、S367以及ATM的S403三个位点的磷酸化。进一步讲，Chk2介导的MDMX上的S367位点磷酸化，对于刺激14-3-3的结合、MDMX细胞核移入及MDM2的降解有重要作用。另一些研究显示紫外线损伤导致了Chk-1介导的367位点磷酸化［20，27］。MDMX磷酸化减弱了去泛素化酶（deubiquitylat⁃ing enzyme，DUB）HAUSP/USP7的亲和力，而DUB对于MDM2、MDMX以及p53蛋白水平调节具有重要作用［32］。MDMX基础磷酸化发生在CDK2激酶和CK1α的丝氨酸96和289两个位点。丝氨酸96位点磷酸化为了调控MDM2在细胞内的位置，而CK1α介导的磷酸化则影响MDMX-p53之间的作用。MDMX的丝氨酸289位点被证实是CK1α的主要磷酸化位点。笔者发现CK1α被药物抑制或者敲除后，或者与DNA损伤药物合用时，会导致p53的激活。因而，内源性CK1α对于p53的调节很重要［33］。CK1α富含丝/苏氨酸激酶并调节多种细胞路径，比如Wnt/β-catenin通路。有研究显示小鼠模型肠道内特异性敲除CK1α后，导致Wnt通路中β-catenin的表达稳定以及体内p53和p21表达水平的增加，最终导致细胞增殖［33］。

有研究结果表明CK1α能够通过干扰MDMX分子内部之间作用而增强MDMX与p53之间的亲和力［34］。在这个相互作用的过程中，CK1α不仅协同促进MDMX的N端结合到p53蛋白上，而且增强MDMX的酸性结构域与p53核心结构域的结合，从而调节p53蛋白功能。在MDMX与p53蛋白的发生二次结合作用的过程中，MDMX酸性结构域（AD结构域）对于p53正向或者反向的作用，取决于其分子伴侣CK1α是否存在。在CK1α缺乏的情况下，MDMX的AD结构域能够模仿p53自动抑制结构域，封闭了p53的自身抑制功能。反之，如果CK1α存在情况下，MDMX的AD结构域不再封闭p53的N端，而是进一步与p53蛋白的核心结构域形成二次结合，从而抑制p53的DNA结合功能。这种机制是需要DNA损伤信号的紧密调节。先前研究显示DNA损伤过程中Chk2介导的MDMX的367位点磷酸化，干扰了MDMXCK1α之间的相互作用。这个过程抑制了MDMX-p53复合物的结合，隐藏了MDMX与p53蛋白结合位点，减弱了其对p53蛋白的抑制调节功能［35］。因此，DNA损伤过程通过抑制MDM2介导的泛素化稳定了p53蛋白功能，而且通过中和MDMX的抑制作用，增加了p53与目的DNA的结合［35］。

总之，MDMX的自身调控以及CK1α的协同调节过程是p53抑癌蛋白分子调控的主要机制。而对这种调节机制的进一步研究为以后MDMX抑制性药物的发现提供了新的思路。

［1］Wade M，Li YC，Wahl GM.MDM2，MDMX and p53 in oncogenesis and cancer therapy［J］.Nat Rev Cancer，2013，13（2）:83-96.doi: 10.1038/nrc3430.

［2］Soussi T.The TP53 gene network in a postgenomic era［J］.Hum Mu⁃tat，2014，35（6）:641-642.doi:10.1002/humu.22562.

［3］Hock AK，Vousden KH.The role of ubiquitin modification in the reg⁃ulation of p53［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1843（1）:137-149.doi: 10.1016/j.bbamcr.

［4］Selivanova G.Wild type p53 reactivation:from lab bench to clinic［J］.FEBS Lett，2014，588（16）:2628-2638.doi:10.1016/j.febslet. 2014.03.049.

［5］Haupt Y，Maya R，Kazaz A，et al.Mdm2 promotes the rapid degradation of p53［J］.Nature，1997，387（6630）:296-299.doi:10.1038/387296a0.

［6］Berberich SJ.Mdm2 and MdmX involvement in human cancer［J］. Subcell Biochem，2014，85:263-280.doi:10.1007/978-94-017-9211-0_15.

［7］Chen L，Gilkes DM，Pan Y，et al.ATM and Chk2-dependent phos⁃phorylation of MDMX contribute to p53 activation after DNA damage［J］.EMBO J，2005，24（19）:3411-3422.doi:10.1038/sj.emboj.7600812.

［8］Wang X，Jiang X.Mdm2 and MdmX partner to regulate p53［J］.FEBS

［9］Phillips A，Teunisse A，Lam S，et al.HDMX-L is expressed from a functional p53-responsive promoter in the first intron of the HDMX gene and participates in an autoregulatory feedback loop to control p53 activity［J］.J Biol Chem，2010，285（38）:29111-29127.doi: 10.1074/jbc.M110.129726.

［10］Pei D，Zhang Y，Zheng J.Regulation of p53:a collaboration be⁃tween Mdm2 and Mdmx［J］.Oncotarget，2012，3（3）:228-235.

［11］Toledo F，Krummel KA，Lee CJ，et al.A mouse p53 mutant lacking the proline-rich domain rescues Mdm4 deficiency and provides in⁃sight into the Mdm2-Mdm4-p53 regulatory network［J］.Cancer Cell，2006，9（4）:273-285.doi:10.1016/j.ccr.2006.03.014.

［12］Riemenschneider MJ，Büschges R，Wolter M，et al.Amplification and overexpression of the MDM4（MDMX）gene from 1q32 in a sub⁃set of malignant gliomas without TP53 mutation or MDM2 amplifica⁃tion［J］.Cancer Res，1999，59（24）:6091-6096.

［13］Lenos K，de Lange J，Teunisse AF，et al.Oncogenic functions of hM⁃DMX in in vitro transformation of primary human fibroblasts and embryonic retinoblasts［J］.Mol Cancer，2011，10:111.doi:10.1186/ 1476-4598-10-111.

［14］Laurie NA，Donovan SL，Shih CS，et al.Inactivation of the p53 path⁃wayinretinoblastoma［J］.Nature，2006，444（7115）:61-66.doi: 10.1038/nature05194.

［15］Danovi D，Meulmeester E，Pasini D，et al.Amplification of Mdmx（or Mdm4）directly contributes to tumor formation by inhibiting p53 tu⁃mor suppressor activity［J］.Mol Cell Biol，2004，24（13）:5835-5843. doi:10.1128/MCB.24.13.5835-5843.

［16］Li B，Cheng Q，Li Z，et al.p53 inactivation by MDM2 and MDMX negative feedback loops in testicular germ cell tumors［J］.Cell Cycle，2010，9（7）:1411-1420.

［17］Zhang Q，Zeng SX，Lu H.Targeting p53-MDM2-MDMX loop for cancer therapy［J］.Subcell Biochem，2014，85:281-319.doi:10.1007/ 978-94-017-9211-0_16.

［18］Wang X，Wang J，Jiang X.MdmX protein is essential for Mdm2 pro⁃tein-mediated p53 polyubiquitination［J］.J Biol Chem，2011，286（27）:23725-23734.doi:10.1074/jbc.M110.213868.

［19］Li X，Gilkes D，Li B，et al.Abnormal MDMX degradation in tumor cells due to ARF deficiency［J］.Oncogene，2012，31（32）:3721-3732. doi:10.1038/onc.2011.534.

［20］Gilkes DM，Chen L，Chen J.MDMX regulation of p53 response to ri⁃bosomal stress［J］.EMBO J，2006，25（23）:5614-5625.doi:10.1038/sj. emboj.7601424.

［21］Pan Y，Chen J.Modification of MDMX by sumoylation［J］.Biochem BiophysResCommun，2005，332（3）:702-709.doi:10.1016/j. bbrc.2005.05.012.

［22］Carrillo AM，Bouska A，Arrate MP，et al.Mdmx promotes genomic instability independent of p53 and Mdm2［J］.Oncogene，2015，34（7）: 846-856.doi:10.1038/onc.2014.27.

［23］Li C，Chen L，Chen J.DNA damage induces MDMX nuclear translo⁃cation by p53-dependent and-independent mechanisms［J］.Mol Cell Biol，2002，22（21）:7562-7571.doi:10.1128/MCB.22.21.7562-7571.

［24］Linares LK，Hengstermann A，Ciechanover A，et al.HdmX stimu⁃lates Hdm2-mediated ubiquitination and degradation of p53［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（21）:12009-12014.doi:10.1073/ pnas.2030930100.

［25］Marine JC，Jochemsen AG.Mdmx as an essential regulator of p53 ac⁃tivity［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，331（3）:750-760.doi: 10.1016/j.bbrc.2005.03.151.

［26］Pereg Y，Shkedy D，de Graaf P，et al.Phosphorylation of Hdmx medi⁃ates its Hdm2-and ATM-dependent degradation in response to DNA damage［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（14）:5056-5061. doi:10.1073/pnas.0408595102.

［27］Chen L，Gilkes DM，Pan Y，et al.ATM and Chk2-dependent phos⁃phorylation of MDMX contribute to p53 activation after DNA dam⁃age［J］.The EMBO J，2005，24（19）:3411-3422.doi:10.1038/sj.em⁃boj.7600812.

［28］Chen L，Borcherds W，Wu S，et al.Autoinhibition of MDMX by intra⁃molecular p53 mimicry［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（15）: 4624-4629.doi:10.1073/pnas.1420833112.

［29］Huang L，Yan Z，Liao X，et al.The p53 inhibitors MDM2/MDMX complex is required for control of p53 activity in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（29）:12001-12006.doi:10.1073/pnas.1102309108.

［30］Pant V，Xiong S，Iwakuma T，et al.Heterodimerization of Mdm2 and Mdm4 is critical for regulating p53 activity during embryogenesis but dispensable for p53 and Mdm2 stability［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（29）:11995-2000.doi:10.1073/pnas.1102241108.

［31］Chen L，Li C，Pan Y，et al.Regulation of p53-MDMX interaction by casein kinase 1 alpha［J］.Mol Cell Biol，2005，25（15）:6509-6520.doi: 10.1128/MCB.25.15.6509-6520.

［32］Sun XX，Dai MS.Deubiquitinating enzyme regulation of the p53 pathway:A lesson from Otub1［J］.World J Biol Chem，2014，5（2）:75-84.doi:10.4331/wjbc.v5.i2.75.

［33］Borgal L，Rinschen MM，Dafinger C，et al.Casein kinase 1α phos⁃phorylates the Wnt regulator Jade-1 and modulates its activity［J］.J BiolChem，2014，289（38）:26344-26356.doi:10.1074/jbc. M114.562165.

［34］Wu S，Chen L，Becker A，et al.Casein kinase 1 alpha regulates an MDMX intramolecular interaction to stimulate p53 binding［J］.Mol Cell Biol，2012，32（23）:4821-4832.doi:10.1128/MCB.00851-12.

［35］Cheng Q，Chen L，Li Z，et al.ATM activates p53 by regulating MDM2 oligomerization and E3 processivity［J］.The EMBO J，2009，28（24）:3857-3867.doi:10.1038/emboj.2009.294.

（2015-06-12收稿 2015-06-30修回）

（本文编辑 闫娟）

Research progress of regulation mechanism of MDMX and CK1α in p53 tumor suppressor protein

WEI Xi1，ZHANG Sheng1，GAO Ming2△
1 Department of Diagnostic and Therapeutic Ultrasonography，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2 Thyroid Cancer Department△

As a tumor suppressor，p53 is activated by numerous cellular and environmental signals，and plays a critical

tumor suppressor protein p53；casein kinase 1 alpha；p53；murine double minute 4

R730

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.031

，2012，586（10）:1390-1396.

10.1016/j.febslet.2012.02.049.

国家自然科学基金青年项目（81401412）

1天津医科大学肿瘤医院超声诊疗科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室（邮编300060），2甲状腺颈部肿瘤科

魏玺（1982），男，医学博士，主要从事超声分子诊断及分子生物学的研究

△通讯作者E-mail：gaoming68@aliyun.com

role in the cell cycle regulation，cell apoptosis and senenscence.The murine double minute（MDM）2 and double minute mu⁃rine 4（MDMX）are two important regulators.MDMX is a p53 binding protein with strong sequence homology to MDM2，but lacks ubiquitin ligase activity，and which is unable to target p53 for proteasomal degradation.MDMX regulates p53 activity through its binding with p53 and its postranscriptional modification.MDMX in the closed and open structure binds to p53 to regulate its activity.As the main partner of MDMX，casein kinase 1 alpha（CK1α）disrupts the intramolecular binding in MD⁃MX in the cooperation to regulate p53 activity.The process of MDMX and CK1α in the regulation of p53 is multi-step and complicated.In this paper the mechanism of MDMX and CK1α in the regulation of p53 protein was reviewed.