基因芯片技术在肾病综合征研究中的应用前景

张碧丽，郁晓腾

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是由于肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增高、大量血浆蛋白从尿中丢失而导致一系列病理生理改变的临床综合征，以大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症和水肿为主要临床特点，目前发病机制尚未完全阐明。基因芯片技术是20世纪90年代初期发展起来的综合了分子生物学、半导体微电子技术、激光化学、计算机科学等众多学科的一门高新技术，其依据核酸分子杂交原理检测待测样品的基因序列及表达的信息，具有高通量、集成化、微型化及自动化的特点[1-2]。目前基因芯片已经发展出多种类型，如Oligo芯片、mRNA表达谱芯片、microRNA芯片、cDNA芯片及DNA甲基化芯片等，涉及基因表达检测、药物靶点筛选、新基因识别及基因功能研究等众多研究领域。高兴等[3]利用基因芯片技术进行多种食源性致病菌的筛查检测，得出随机引物PCR联合基因芯片技术进行食源性致病菌检测的体系完全可行，为病原细菌高通量筛查提供了新的理论和技术基础。尹丰等[4]利用基因芯片技术筛选人脑胶质瘤细胞（GSCs）和正常神经干细胞（NSCs）中差异表达的基因，揭示了GSCs和NSCs在mRNA表达水平的差异，由mRNA所控制的转录调节网络对NSCs向GSCs的恶性转化具有重要影响，为探索脑胶质瘤的发生机制及靶向治疗提供了线索。基因芯片技术可以从基因水平分析NS的致病机制和药物治疗的作用靶点。本文主要对基因芯片技术在NS中的研究应用进行综述。

1 基因芯片技术的原理及与高通量测序技术的比较

基因芯片技术的具体程序是把大量已知基因序列探针集成于同一张芯片，将经过标记后的靶核苷酸序列与之杂交，通过检测杂交信号，对待测样品中的基因信息进行高通量的分析[5]。高通量测序技术是近年来发展起来的另外一种高通量基因组学研究方法，也称其为深度测序技术[6]。与高通量测序技术比较，基因芯片技术具有技术稳定、杂交结果分析直观、快速等优点，其缺点在于基因芯片技术只能检测已知序列的特征，没有发现新信息的能力。近几年发展起来的Target-sequencing或者称为序列捕获技术，先利用芯片探针捕获待测片段，再用深度测序技术分析核酸序列，充分综合了两者的优势，解决了单一技术难以解决的问题[7-8]。

2 基因芯片技术在NS研究中的应用

目前认为NS的发生是由多基因参与的复杂过程。因此，在探索NS发病机制的过程中，能否将NS相关致病基因作为一个整体进行研究，成为解决这一问题的关键。基因芯片技术可实现在mRNA水平上同时平行研究成千乃至上万条基因的表达关系，为揭示NS的发病机制提供了有力工具。

2.1 基因芯片技术与微小病变性肾病（MCNS） MCNS是儿童NS中最常见的病理类型。有学者认为MCNS是由于免疫细胞的功能障碍，可能导致肾小球致通透性因子的释放[9]。Komatsuda等[10]利用包含24 446个cDNA的微阵列，检测2例MCNS患者肾病活动期和缓解期外周血单个核细胞（PBMC）mRNA的表达，发现在肾病活动期有171个功能已知的基因表达发生了上调，其中21个基因编码的蛋白可参与信号转导和细胞因子的反应，通过qRT-PCR验证24例MCNS患者、10例膜性肾病（MN）患者和24例健康对照者，证实MCNS患者PBMC中趋化因子13（CCL13）和半乳糖凝集素相关蛋白（hspc159）的mRNA表达均明显高于MN患者和健康对照组。大量研究表明，CCL13参与许多炎症性疾病，其通过与受体结合选择性趋化炎性细胞并调控关键的激活程序，推测其可能与MCNS患者的免疫炎症反应有关[11]。hspc159属于凝集素家族，可以调节Th1/Th2细胞因子的平衡，Th1/Th2细胞因子的平衡失调被认为参与了许多自身免疫性疾病，推测hspc159的高表达与MCNS患者Th2细胞为主的免疫反应有关[12]。组蛋白赖氨酸甲基化是一种重要的表观遗传修饰，被认为参与了多个生物学过程，组蛋白赖氨酸甲基化模式的异常改变，使得染色质的结构发生改变，可进一步导致失调基因的转录和疾病进展。Zhang等[13]采用ChIP-chip试验方法检测15例MCNS患者和15例正常对照者PBMC组蛋白H3赖氨酸4甲基化（H3K4me3）后基因表达的变化，发现MCNS组有841个基因表达上调、231个基因表达下调，采用qRT-PCR验证了表达明显上调的白细胞介素（IL）-4受体（R）、prkd2基因，与芯片结果一致，揭示了这些基因mRNA的表达和H3K4me3水平呈正相关关系。IL-4R基因编码IL-4R的α链，通过与IL-4结合促进Th2细胞的分化，而prkd2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，其在多种细胞表达，调节包括免疫反应在内的多种细胞反应，并且prkd2对内皮细胞的增殖和迁移起着重要作用，这些显著变化的基因有助于解释MCNS患者免疫功能紊乱[14-15]。此外，还发现H3K4me3和MCNS患者启动子DNA甲基化之间存在负相关关系[13]。Kobayashi等[16]利用DNA甲基化芯片分别检测6例MCNS患者缓解期、复发期的外周血的单核细胞和Th细胞，结果显示从缓解期到复发期DNA甲基化模式主要发生在Th细胞，GATA2、PBX4和NYX 3个基因的表达显著降低，表明表观遗传调控Th细胞是MCNS的发生机制。

以上研究表明，T淋巴细胞基因的异常表达导致细胞免疫功能障碍，引发肾小球滤过膜通透性改变，参与了NS的发病。利用基因芯片技术筛选差异性表达基因，并探讨各个基因之间的相互关系和作用，是最终阐明NS发病机制和寻找药物治疗靶点的关键。

2.2 基因芯片技术与局灶节段性肾小球硬化（FSGS） 近年来，儿童FSGS的发病率一直在增长，是导致儿童慢性肾衰竭的重要原因。研究认为FSGS的发生和足细胞损伤或数目减少有关[17]。足细胞表达许多特殊的蛋白分子，如nephrin、CD2AP、Podacalycin等，这些蛋白的编码基因突变或缺失可以导致足细胞的结构和功能改变[18-19]。Jeffrey等[20]通过比较FSGS患者、MCNS患者及正常人的基因表达谱变化，发现FSGS组较MCNS组、正常组有316个基因表达发生显著差异，其中nephrin的表达下降近2倍，足细胞特异性肌动蛋白相关蛋白（Synaptopodin）表达下降近3倍，还有一些构成足细胞裂孔隔膜（SD）复合体的分子，如FAT1、MAGI2和TJP1的表达同样降低，证实足细胞结构改变与FSGS的发生密切相关。通过聚类分析，揭示这些基因的功能涉及细胞周期与细胞增殖、细胞骨架与运动、细胞信号转导等多个方面，细胞增殖周期中转录因子的再激活和过表达很可能与FSGS发病机制有关[20]。Bennett等[21]研究发现 FSGS患者 NPSH1、WT1、nephrin、ACTN4等足细胞相关基因表达明显下调，进一步证实足细胞损伤与FCGS发生密切相关。同时有研究证实血管内皮生长因子（VEGF）表达的下降与蛋白尿有关，而转化生长因子（TGF）-β信号通路表达增强[20]。目前研究证实，TGF-β信号通路表达增强可导致肾脏纤维化的进展[23]。另有研究表明，激素抵抗性肾病综合征和TGF-β1的表达上调有密切关系[24]。目前TGF-β1已被公认是治疗肾小球硬化的靶点。有研究表明血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）类药物可以下调TGF-β1的表达，达到干预FSGS进展的作用[25]。

2.3 基因芯片技术与膜性肾病（MN） MN是成人NS中最常见的病理类型，以基底膜弥漫性增厚及上皮下免疫复合物沉积为特征，其发病机制目前仍不明了。Sui等[26]利用基因芯片技术研究MN与正常人PBMC组蛋白H3赖氨酸9（H3K9me3）甲基化修饰后的变化，发现MN患者有108个基因表达发生了明显变化，通过qRT-PCR验证了DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC3、BIRC2 基因表达明显上调，与芯片结果一致，其中CNTN4编码黏附蛋白，属于免疫球蛋白家族的成员。另有研究显示CNTN4基因表达上调，可能与MN免疫复合物沉积有关[27]，为探讨MN的发病机制及治疗提供了方向。Wu等[28]以胎龄6周的BALB/c小鼠为研究对象，模型组予以阳离子化的牛血清白蛋白（C-BSA）造成MN，利用基因芯片分别检测模型组和对照组小鼠肾皮质，结果模型组有175个基因呈显著差异性表达，从中筛选出4个与损伤、炎症、细胞基质相互作用有关的基因MT-1、CTSD、lamr-1和LY6进行PCR验证，与芯片结果一致。其中LY6在以往的研究中被证实和蛋白尿的发生及狼疮肾损害有关[29]；而CTSD编码的组织蛋白酶D正常情况下分布于远端肾小管和集合管系统，其表达增加可见于链球菌感染后肾小球肾炎[30]。王琳等[31]利用Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0探索特发MN患者全基因组拷贝数变异（CNVS）与参芪膜肾方疗效的关系，观察到参芪膜肾方治疗有效组和无效组在第5、6、8号染色体检测到的CNVS差异有统计学意义，其中位于6号染色体上的HLA族基因在有效组多数病例中表现为拷贝数扩增，而无效组的多数病例则表现为拷贝数缺失，得出基因背景差异可能是导致参芪膜肾方取得不同疗效的原因，HLA的同族基因拷贝数变异影响参芪膜肾方疗效的发挥，前者有望成为该方治疗MN的疗效预测因子。

2.4 基因芯片技术与系膜增生性肾小球肾炎 系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）是以不同程度的系膜区增宽、系膜细胞增生、系膜基质增多为主要病理特征的肾小球疾病。通过给大鼠静脉注射单克隆抗Thy-1抗体模拟慢性肾小球肾炎模型，可以观察到肾小球系膜及系膜细胞的显著增殖，类似MsPGN[32]。Sadlier等[33]利用Oligo芯片分别检测注射抗Thy-1抗体后第0、2、5、7、14天大鼠肾皮质基因表达谱，发现在第5天PDGF、TGF-β等促细胞增殖基因的表达显著增加，通过聚类分析发现了新的促系膜细胞增殖基因S100家族。Tsuji等[34]利用基因芯片技术比较不可逆模型组（静脉注射1-22-3抗体并切除单侧肾脏）、可逆模型组（单纯静脉注射1-22-3抗体）大鼠之间差异表达基因，检测出有189个基因发生差异表达，而且大多数的差异基因发现于第4天，提示基因表达的早期变化决定了疾病的不可逆性，其中胸腺肽-β10在不可逆组显著表达，推测肾脏疾病发生的共同机制可能涉及间质纤维化和巨噬细胞浸润。Hong等[35]通过芯片检测模型组大鼠在不同时间点基因表达谱的变化来研究DNA结合转录因子KLF-15对肾小球系膜细胞的影响，结果表明KLF可能通过调节细胞周期蛋白E2F1的表达抑制肾小球系膜细胞的增殖，其可作为治疗系膜增生性肾小球肾炎的一个靶点。

3 问题与展望

基因芯片技术经过近20余年的快速发展，已经成为了一个非常稳定可靠的实验技术，并展现出其快速性、高效性、准确性的优势。这一技术在肾脏疾病发生机制的研究及药物治疗靶点的筛选中发挥着重要作用，但仍存在一些问题需要完善，比如，如何降低芯片的成本，如何简化实验流程，提高检测结果的特异性等。随着研究的深入和这些问题的不断解决，基因芯片技术将在肾脏疾病的研究中发挥更重要的作用。

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