内质网应激在眼科疾病中的研究进展

王 鹏 综述，盛敏杰 审校



·综 述·

内质网应激在眼科疾病中的研究进展

王 鹏 综述，盛敏杰 审校

(同济大学附属第十人民医院眼科，上海 200072)

内质网是一种负责蛋白质合成、折叠以及转运，脂类生物合成，空泡运输以及胞内钙存储的多功能细胞器。内质网腔内未折叠蛋白质的蓄积及钙离子稳态的打破，诱发内质网应激，发生具有保护性的未折叠蛋白反应。内质网应激与多个信号通路相互联系，参与炎症、凋亡的发生发展，近年来得到越来越多的关注。本文就内质网应激发生机制及相关的眼科疾病的研究进展作一综述。

内质网；内质网应激；眼科疾病

内质网是蛋白质折叠和组装的场所，多种生理性及病理性因素能够干扰内质网的质量控制，导致内质网腔内未折叠蛋白的累积，即为内质网应激(endoplasmic reciculm stress, ERS)。为了维持内质网内蛋白质合成的稳态，真核细胞进而发生具有保护作用的未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)[1]。越来越多的研究证实，ERS与多种眼科疾病的发生发展密切相关。本文对ERS在相关眼科疾病中的研究进展作一综述。

1 ERS

1.1 未折叠蛋白反应

ERS初期，UPR抑制蛋白质转录，促进蛋白质折叠并阻止未折叠蛋白的聚集。UPR信号通路主要通过3种ERS感受器介导激活。ERS感受器属于跨膜蛋白，包括活化转录因子6(activating transcription factor6, ATF6),1型ER转膜蛋白激酶(type-1 ER transmembrane protein kinase, IRE-1)以及双链RNA依赖蛋白激酶样ER激酶(PKR like endoplasmic reticulum kinase, PERK)。三者与ER分子伴侣GRP78(glucose-regulated protein78)结合而处于非活化状态。应激条件时，GRP78从内质网腔表面脱离，引发上述3种感受器蛋白的自我磷酸化和二聚化，从而引起UPR的发生[2]。ATF6是一种促转录因子。在高尔基体内被蛋白裂解，并转运至细胞核，与交叉结合型XBP1结合，进而激活编码基因转录翻译，增强ER的蛋白折叠能力[3]。转膜激酶IRE1 α和β具有RNA酶活性，通过特异性位点结合XBP1 mRNA形成转录因子(sXBP1)，sXBP1与ATF6具有协同作用，引起内质网内伴侣分子水平升高。IRE1通过调节性IRE1依赖性退变(regulated-IRE1-dependent decay,RIDD)作用，混杂退化多种mRNA活性，进而抑制蛋白质的合成。PERK是内质网I型跨膜蛋白，与GRP78解离后通过胞浆内结构域的自身二聚化和磷酸化而激活，从而减缓或暂停蛋白的合成。蛋白质合成的减缓或暂停是ERS调控蛋白质表达速度最快捷的方式[4]。

1.2 内质网相关性降解

正确折叠的蛋白被输送至高尔基体等目标位置，而错误折叠的蛋白被逆向转运至细胞质中进行降解，该降解过程被称为内质网相关性降解(ER-associatedprotein degradation, ERAD)。ERS发生时，ERAD是内质网中用来减少错误折叠蛋白以及未折叠蛋白水平的重要途径，是缓解ERS的重要补充机制，大多ERAD作用底物在被蛋白酶降解前已被泛素化。ERAD介导未折叠蛋白及错误折叠蛋白的逆向转运，后者进而被泛素化蛋白酶体降解，维护内质网内蛋白平衡。

1.3 内质网钙稳态失衡

研究发现，Ca2+既是凋亡信号的传导分子，又是凋亡效应分子。内质网腔是Ca2+的主要储存场所。Ca2+从内质网的释放受内质网钙通道蛋白(RyRs)、肌醇1，2，5-3磷酸受体(IP3R)以及异位子(translocon)的调控。而内质网钙的储存，则是内质网膜上钙泵(SERCA)执行[5]。钙网蛋白(Calreticulin)是主要的内质网钙结合伴侣分子，调控内质网蛋白质的正确折叠。因此，Ca2+水平的波动严重影响蛋白质折叠能力并引起细胞凋亡，Ca2+的改变不仅在内质网，同时在一些ERS相关凋亡机制方面发挥重要作用。研究发现，错误折叠蛋白以及钙离子的过载，均可以通过依赖性Bcl-2机制引起细胞凋亡[6]。

1.4 凋亡

当细胞损伤因素未能得到缓解或进一步增强,UPR反应以及ERAD等不能维持内质网内蛋白及钙平衡时，凋亡信号通路将被激活，进而引发细胞凋亡。截至目前，学界普遍认同3种凋亡信号通路：C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)/生长停滞及DNA损伤基因153(gene for growth arrest and DNA damage153, GADD153)通路[7]；c-Jun氨基末端激酶(cJUN NH2-terminal kinase, JNK)通路[8]；内质网特有的半胱氨酸蛋白酶Caspase-12通路[9]。

2 ERS在眼科疾病中的研究

近年来，ERS参与多种眼科疾病的发生发展，得到国内外学者和眼科医生的广泛关注。

2.1 青光眼

原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)是一种常见的迟发性神经退行性病变。临床上，小梁网细胞数量的减少被视为POAG的特征性表现。研究发现，POAG患者小梁网细胞ERS标志蛋白GPR78表达下调，打乱了细胞的防御机制，使细胞对ERS敏感性增加，进而细胞丧失保护功能，最终导致小梁网细胞凋亡。进一步的研究发现，ERS的远期损伤与原发性开角型青光眼的小梁网功能紊乱及病程发展密切相关[10]。此外，Zillig等[11]发现，MYOC编码的肌纤蛋白(myocilin)和POAG密切相关,指出myocilin突变体的堆积可导致GRP78的表达明显上调，进而引起细胞形态的改变以及抑制细胞再生。研究发现，因为myocilin突变体不能由内质网转移至高尔基体中，造成内质网中myocilin大量堆积，诱发UPR，导致小梁网细胞凋亡。Zode等[12]发现，携带突变MYOC的转基因小鼠，小鼠眼压明显升高，免疫印迹学检测发现CHOP表达量明显上调，局部应用ERS抑制剂4-苯基丁酸等可明显降低小鼠眼内压，进一步证实ERS与POAG密切相关。

青光眼引发的视网膜损伤主要包括内层视网膜变薄及神经节细胞数量的显著减少。研究表明，ERS参与了神经节细胞凋亡的过程。Zode等[13]发现，在慢性青光眼模型中，PERK-CHOP通路介导神经节细胞凋亡，证明ERS与神经节细胞凋亡密切相关。研究[14]通过研究慢性青光眼大鼠模型，发现大鼠神经节细胞数量显著降低，免疫印迹学检测到GRP78及CHOP水平在建模后1～2周显著升高，8周内持续高水平表达，证实了ERS造成神经节细胞的凋亡。

2.2 白内障

环境、营养和代谢等多种因素影响白内障的发生发展，而这些因素同样也是ERS激活的诱导因素。研究发现晶状体上皮细胞的凋亡是白内障形成的细胞学基础，晶状体上皮细胞的凋亡可由未折叠蛋白聚集而诱发。当内质网腔处于高氧化环境条件下，引起未折叠蛋白大量聚集，激活UPR并导致活性氧的过量产生，活性氧能够降低晶状体内还原性谷胱甘肽的浓度，从而进一步恶化内质网腔内微环境，最终诱导晶状体上皮细胞凋亡导致白内障的发生。有学者通过制造早期白内障动物模型，发现亚硝酸盐可与细胞膜和晶状体分泌型蛋白相互作用，引起蛋白构象改变，发生重度ERS。ERS进一步激活细胞自救，引起UPR，释放内质网腔内钙离子，以及活性氧的过表达，引起细胞凋亡[15]。Mulbern等[16]在高糖以及低糖环境培养晶状体上皮细胞，检测到GRP78、CHOP、ATF4及Caspase-12表达量明显升高。Palsamy等[17]发现晶状体上皮细胞在高糖环境培养下，细胞自发合成丙酮醛，诱导ERS及UPR，进而引起活性氧的产生及内质网钙离子释放进入胞浆，最终导致细胞凋亡。

Palsamy等[17]指出，高浓度同型半胱氨酸与青少年白内障及年龄相关性白内障密切相关。同型半胱氨酸通过二硫键与蛋白质相互作用，导致内质网中未折叠蛋白质堆积，继而诱导UPR激活、活性氧的过量表达、钙离子的释放和m-钙蛋白酶的激活以及Nrf2的蛋白水解作用，导致Nrf2依赖性抗氧化防卫功能失效，最终导致晶状体上皮细胞凋亡。

2.3 年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是以黄斑区及其周围的光感受器细胞进行性丢失为特征的疾病，年龄、遗传、肥胖、吸烟及高血压都是导致发病的危险因素。有学者近期关注了ERS在AMD的作用及引起脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)的潜在可能性，发现氧化应激作为AMD的危险因素同样也能够引起ERS及UPR[18]。Lin等[19]在发生病变的黄斑的光感受器及视网膜色素上皮组织中检测出ERS及UPR的发生。Kunchithapautham等[20]使用香烟制造AMD小鼠模型，RT-PCR检测发现视网膜色素上皮中，GRP78及CHOP表达量分别提高2.5倍和8.5倍。为了验证上述结果，研究进而对单层视网膜色素上皮进行RT-PCR检测，发现GRP78及CHOP表达量分别提高3倍和13倍，同时免疫印迹学检测GRP78及CHOP表达量同样明显上调，应用共聚焦显微镜也可以检测到内质网腔内存在大量的GRP78和CHOP，提示AMD与ERS存在一定的联系。

通过Bruch膜长入色素上皮或神经上皮下形成的CNV是干湿性AMD最显著区别，VEGF的过量表达被视为CNV的关键环节。Ghosh等[21]发现，在AMD病程的发展过程中，RPE细胞中持续存在的ERS引发VEGF过度表达。

2.4 糖尿病性视网膜病变

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)发病机制复杂。近年来，ERS在DR发病机制中的作用得到了广泛关注。Li等[22]应用链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型，发现早期病变的视网膜组织中CHOP表达量显著上升。进一步的研究发现，在高糖环境下，氧化应激引起过量活性氧生成并积聚，对组织造成慢性损伤，最终引起视网膜微血管内皮细胞大量凋亡。

炎症反应在DR的发生发展过程中扮演重要角色。在与DR相关的众多炎症因子中，VEGF起到关键作用，其通过一系列反应引起微血管周细胞凋亡、新生血管生成以及内皮细胞增殖造成血管腔狭窄闭塞。近年来研究发现ERS对炎症因子的诱导产生发挥着重要作用。正常情况下，视网膜周细胞、内皮细胞合成并分泌VEGF，用以维持视网膜血管的正常生物学功能。当糖尿病病发时，ERS继而发生，导致内皮细胞、周细胞等细胞内VEGF转录水平增高。有学者[23]通过研究糖尿病性视网膜病变动物模型，指出ERS与DR发病过程中视网膜炎症反应的发生存在密切联系。此前有研究[24]发现在DR患者玻璃体内VEGF水平明显上升，进一步研究证实主要由PERK通路及ATF4通路介导，证明VEGF的产生与ERS密切相关。此外，ERAD被认为参与DR的发病机制。Yan等[25]发现，在建立糖尿病性视网膜病变动物模型第1个月时，8种ERS因子表达量发生改变，3个月时新增10种ERS因子表达量发生改变，表明DR在疾病发展过程中，越来越多的ERS因子参与了疾病的发展。其中，ERAD信号通路相关因子表达量的减少，可能导致局部炎症反应及DR的发生。

2.5 干眼病

干眼病主要引起眼部不适、视力干扰以及泪膜不稳定性增加，进而泪膜渗透压升高，最终造成眼表损伤。Seo等[26]应用透射式电子显微镜观察干眼小鼠模型泪腺细胞，发现与正常小鼠相比，干眼小鼠泪腺细胞内质网囊明显膨胀。Western印迹法检测发现，CHOP、eIF2α及p-PERK表达明显上调，表明干眼病可引起UPR以及ERS的发生。

3 展 望

综上所述，随着对ERS及其自我调控机制与眼科疾病关系认识的加深，不仅有利于深入了解相关眼科疾病的发病机制，同时也可通过干预ERS过程，研制新型靶点药物，为预防和治疗相关眼科疾病提供更为广阔的研究前景。

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Progress on eye diseases with endoplasmic reticulum stress

WANGPeng,SHENGMin-jie

(Dept.of Ophthalmology，Tenth People’s Hospital，Tongji University，Shanghai 200072，China)

The endoplasmic reticulum (ER) is a multifunctional organelle which is responsible for protein synthesis, folding and export, lipid biosynthesis, vesicular traffic and cellular calcium storage.ER stress (ERS) is induced by the accumulation of unfolded protein and disorder of calcium iron, which result in protective unfolded protein response (UPR).This article reviews the mechanism of ERS, and eye diseases associated with ERS in current researches.

endoplasmic reticulum; endoplasmic reticulum stress; eye diseases

10.16118/j.1008-0392.2015.05.026

2014-09-30

国家自然科学基金(81300771)

王 鹏(1987—)，男，硕士.E-mail：17091263956@163.com

盛敏杰.E-mail：drsmjyx@163.com

R 77

A

1008-0392(2015)05-0120-05