高效液相色谱法测定安徽产木通药材中3种有效成分含量

2015-02-11欧金梅储晓琴

安徽中医药大学学报 2015年1期

欧金梅，储晓琴，2，张虹

（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012；2.现代中药安徽省重点实验室，安徽合肥 230012）

木通始载于《神农本草经》，具有利尿通淋、清心除烦、通经下乳的功效[1]。《中华人民共和国药典》规定，木通的来源为木通科木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三叶木通Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.和白木通Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.var.australis（Diels）Rehd.的藤茎[2]，有效成分为木通苯乙醇苷B、齐墩果酸、常春藤皂苷元等[3]。木通产于长江流域各省区，在日本和朝鲜有分布，长期依赖野生资源，量少不能满足市场需要，因此药材市场及医院多以川木通代替木通使用。在第四次全国中药资源调查中发现，木通、三叶木通在安徽有分布，木通主要分布在明光、滁州、巢湖、青阳、宁国等江淮丘陵及皖南山区，资源丰富；三叶木通主要分布在宁国、黄山、歙县等皖南山区。如能进一步开发利用，可解决市场上木通药材紧缺的问题。

本实验以安徽产木通为对象，通过查阅相关文献[4－10]，采用高效液相色谱法测定木通中木通苯乙醇苷B、齐墩果酸、常春藤皂苷元的含量，并与市售湖北产木通及川木通进行比较，以期为安徽产木通的质量研究提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AG285电子天平：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；LC-20AB高效液相色谱仪（包括SPD-M20A紫外检测器、LC-20AB高压输液泵、LC-solution色谱工作站）：日本岛津；HH-S2系列恒温水浴锅：江苏省金坛市环宇科学仪器厂；双层铁皮电炉：上海日用电炉厂；KQ-100DB数控超声仪：江苏省昆山超声仪器有限公司；SF-130C万能粉碎机：湖南省吉首市中湘制药机械厂。

1.2 试剂齐墩果酸（批号110709，纯度≥98%）：中国食品药品检定研究院；常春藤皂苷元（批号111733，纯度≥98.3%）：中国食品药品检定研究院；木通苯乙醇苷B（批号FY19730401，纯度≥98%）：江苏省南通飞宇生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。木通药材采集或购买，产地为安徽、湖北、四川，经安徽中医药大学周建理教授鉴定为木通科木通、三叶木通。

2 方法与结果

2.1 木通苯乙醇苷B含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备精密称定木通苯乙醇苷B标准品2.0 mg于50 m L容量瓶中，70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得0.04 mg／m L的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备称取药材粉末（过4号筛）约0.5 g，精密称定，置于50 m L的平底烧瓶中，加70%甲醇25 m L，回流45 min后放至室温，再称定质量，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，过滤。精密移取续滤液4 m L至100 m L容量瓶中，70%甲醇定容，过滤，即得。

2.1.3 色谱条件色谱柱：Alltima C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇－水－磷酸（35∶65∶0.05）；流速：1.0 m L／min；柱温：35℃；进样量：20μL；检测波长：330 nm。对照品和木通药材的高效液相色谱图见图1。

2.1.4 线性关系考察按上述色谱条件，将对照品稀释成0.004 4、0.008 8、0.013 2、0.022 0、0.030 8、0.035 2 mg／m L等一系列浓度，依次进样。结果表明木通苯乙醇B在0.004 4～0.035 2 mg／m L浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y＝2.734 4x＋59 146，r＝0.999 3。

2.1.5 精密度试验精密吸取同一对照品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，记录峰面积，其RSD为0.95%。

2.1.6 稳定性试验称取三叶木通（安徽歙县）粉末，约0.5 g，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样分析，其峰面积 RSD为1.39%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.1.7 重复性试验称取三叶木通（安徽歙县）粉末，约0.5 g，共6份，按“2.1.2”项下方法制成供试品，在上述色谱条件下测定，木通苯乙醇苷B峰面积RSD为1.43%。

2.1.8 加样回收率试验精密称定已知含量的三叶木通粉末6份，每份0.2 g，按“2.1.2”项下方法制成供试品，分别加入一定量的木通苯乙醇苷B对照品，测定并计算加样回收率，结果木通苯乙醇苷B的平均回收率为97.05%，RSD为1.20%。

2.1.9 样品测定取不同产地的木通粉末各0.5 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法操作，在上述色谱条件下测定，计算不同来源的木通药材中木通苯乙醇苷B的含量，测定结果见表1。

2.2 齐墩果酸和常春藤皂苷元含量测定[11－12]

2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称定齐墩果酸和常春藤皂苷元对照品各2.0 mg，置2 m L容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含齐墩果酸1.15 mg／m L、常春藤皂苷元1.1 mg／m L的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备将木通药材（过4号筛）2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 m L，超声提取30 min，过滤，并用适量甲醇洗涤残渣，合并滤液与洗液，水浴蒸干，残渣加10 m L水溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇20 m L、40%盐酸2 m L，加热回流4 h，水解产物加水10 m L，用三氯甲烷萃取3次，合并滤液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并定容至10 m L容量瓶中，摇匀即得。

2.2.3 色谱条件色谱柱：Alltima C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：乙腈－水（65∶35）；流速：1.0 m L／min；柱温：25℃；进样量：20μL；检测波长：203 nm。对照品和木通药材的高效液相色谱图见图2。

2.2.4 线性关系考察按上述色谱条件，齐墩果酸标准品制成0.145、0.233、0.330、0.460、0.580、0.600 mg／m L，常春藤皂苷元标准品制成 0.21、0.33、0.42、0.60、0.70、0.84 mg／m L 等一系列浓度，依次进样。结果表明，齐墩果酸在0.145～0.60 mg／m L范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y＝5 992.4x＋5.0×105，r＝0.999 0。常春藤皂苷元在0.008 4～0.033 6 mg／mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y＝7 108.8x＋8.8×105，r＝0.999 5。

2.2.5 精密度试验取1.15 mg／mL齐墩果酸，1.1 mg／mL常春藤皂苷元对照品溶液，按上述色谱条件，进样40μL，连续进样6次，记录峰面积。齐墩果酸和常春藤皂苷元峰面积的RSD分别为1.93%、1.34%。

2.2.6 稳定性试验称取木通（安徽青阳）粉末，约2 g，按“2.2.2”项下方法制成供试品，分别于0、2、4、6、8、10 h进样分析，分别测得齐墩果酸和常春藤皂苷元峰面积的RSD为1.97%、1.67%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.2.7 重复性试验称取木通（安徽青阳）药材粉末，约2 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制成供试品，在上述色谱条件下测定，齐墩果酸和常春藤皂苷元的 RSD分别是1.19%、1.33%。

2.2.8 加样回收率试验精密称定取已知含量的木通粉末，约2 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制成供试品，精确加入一定量的齐墩果酸对照品和常春藤皂苷元对照品，测定并计算加样回收率，结果齐墩果酸平均回收率为95.43%（RSD＝2.00%），常春藤皂苷元平均回收率为95.04%（RSD＝2.06%）。

2.2.9 样品测定取不同产地的木通各2 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下测定，计算不同来源的木通药材中齐墩果酸和常春藤皂苷元的含量，测定结果见表1。