HPLC-MS/MS法同时测定补肾壮阳类保健食品中非法添加11种化药成分

朱 捷，何 微，马桂娟

（宁夏回族自治区食品检测中心，宁夏 银川 750004）

HPLC-MS/MS法同时测定补肾壮阳类保健食品中非法添加11种化药成分

朱 捷，何 微，马桂娟

（宁夏回族自治区食品检测中心，宁夏 银川 750004）

建立高效液相色谱法及串联质谱法同时测定补肾壮阳类保健食品中非法添加11种化药成分。采用高效液相色谱法考察线性关系、精密度、稳定性以及回收率。采用scan、sim及product ion的扫描方式对11种化合物进行质谱条件的优化。结果11种化药成分峰面积与浓度之间线性关系良好（r≥0.999 9），各组分回收率在96.8%～100.5%之间，稳定性、精密度良好。采用优化后的质谱参数试验，各组份分离度良好，MRM方式准确快速。结论 该法准确快速，适用于补肾壮阳类保健食品非法添加的定性、定量测定以及快速筛查工作。

保健食品; 非法添加; MRM; 快速筛查

保健食品能调节人体的机能，适宜于特定人群食用。但随着该市场的持续发酵，不法商家为求高额利润，向产品中有针对性的添加不同种类的化学药品，从而提高其产品的疗效。消费者服用后，这些化药成分可在短期内降低病理指标，但消费者在不知情的情况下长时间、大剂量的服用会对肝、肾、心脏造成巨大损伤。国家食品药品监督管理局早在2009年就针对该市场的乱象进行有针对的治理。

那非类化药对于补肾壮阳，治疗男性性功能障碍有着非常好的疗效，国家食品药品监督管理局也针对该类保健食品制定了药品检验补充检验方法和检验项目批准件，目的就是为了快速筛查和验证保健食品中是否添加此类化药。目前已有较多学者进行了该类化药的研究[1-3]，但研究多针单一品种化药的非法添加以及部分研究缺少定量方面的考虑，或是研究方法未优化。而该类药物不断更新，在2009年又发现了新型羟基豪莫西地那非[4]。本文参照国家局文件中规定的11种那非类化药的检测方法，在此基础上进行系统的研究，优化定性、定量方法参数，补充稳定性等方法学验证，并为今后对该类保健食品的快检工作以及检测方案修订工作提供一定的参考。

1 实验部分

1.1 仪器

三重四级杆串联质谱仪（Agilent 6460C）、高效液相色谱仪（Agilent 1260）、分析天平、超声波清洗机。

1.2 试剂

甲醇（Fisher HPLC）、乙腈（Fisher HPLC）、磷酸（Fisher HPLC）、乙酸铵（Sigma），水为超纯水。那红地那非（批号：520039-201401 中检院）、红地那非（批号：520047-201401中检院）、氨基他达拉非（批号：520042-201401中检院）、他达拉非（批号：1156-051A1 TLC医药化工有限公司）、枸橼酸羟基豪莫西地那非（批号：510032-201301中检院）、西地那非（批号：510068-201401中检院）、豪莫西地那非（批号：520046-201401中检院）、伪伐地那非（批号：520041-201401中检院）、那莫西地那非（批号：520040-201401中检院）、硫代艾地那非（批号：520048-201401中检院）、伐地那非（批号：1132-035A1 TLC医药化工有限公司）。补肾胶囊（九牛葆胶囊 宁夏自然生物科技有限公司 3批）。

2 实验方法

2.1 高效液相色谱法

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6 mm×250 mm 5μm，流速1.0 mL/min，进样量10μ L，柱温35 ℃，检测波长230 nm，带宽4 nm，流动相A：磷酸三乙胺溶液：甲醇：乙腈（60:20:20），流动相B：磷酸三乙胺溶液：甲醇：乙腈（8:46:46），梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序Table 1 HPLC gradient elution program

2.1.2 对照品溶液的制备

分别精密称取那红地那非对照品9.73 mg、红地那非对照品10.27 mg、氨基他达拉非对照品10.41 mg、他达拉非对照品6.90 mg、枸橼酸羟基豪莫西地那非对照品13.6 mg、西地那非对照品10.43 mg、豪莫西地那非对照品10.21 mg、伪伐地那非对照品10.00 mg、那莫西地那非对照品10.17 mg、硫代艾地那非对照品10.43 mg、伐地那非对照品7.10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成混合对照品溶液。另取各对照品适量，加甲醇制成约0.3 mg/mL的单标溶液。

2.1.3 线性关系的考察

精密吸取混合对照溶液0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加流动相稀释制成约5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg/mL的混合标准溶液，按2.1项下的色谱条件考察线性关系。

2.1.4 样品溶液的制备

取胶囊内容物,精密称定,至于50 mL容量瓶中,加甲醇超声溶解并稀释至刻度,制成mg/mL的溶液，用0.22μm的滤膜过滤，测定。

2.1.5 精密度试验

取线性关系考察中25.0 μg/mL的标准溶液，连续进样6次，计算RSD%。

2.1.6 稳定性试验

取线性关系考察中25.0 μg/mL的标准溶液，于0、2、4、6、12、24小时测定，计算RSD%。2.1.7 加标回收试验

按2.1.4项下方法制备样品溶液，向其中加入混合对照品溶液0.5 mL，用甲醇定容至50 mL，同时制备6组平行样，测定。

2.2 高效液相色谱串联质谱法

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 mm×10 mm 3.5μm、流速0.3 mL/min，进样量10 μ L、柱温35 ℃、流动相A：甲醇（含15%乙腈），流动相B：0.02 mol/L乙酸铵溶液（含0.1%乙酸、15%乙腈），梯度洗脱程序见表2。正离子扫描，扫描范围50～600 amu，离子源温度：300 ℃、鞘气温度：350 ℃、干燥气流速6 L/min、喷嘴压力45 psi、鞘气流速12 L/min。

表2 液相色谱串联质谱梯度洗脱程序Table 2 HPLC-MS/MS gradient elution program

2.2.2 对照品溶液的制备

取2.1.2项下混合对照溶液，加流动相制成约1 μg/mL的混合对照品工作液，另取各物质单标溶液，加流动相制成约1μg/mL的单标对照品工作溶液。

2.2.3 母离子扫描

采用正离子扫描模式分别取单标对照品工作溶液进行母离子扫描，扫描范围50～600。设置不同Fragment电压，优化Fragment电压。另取混合对照品工作液，按优化后条件测定。

2.2.4 子离子扫描

分别取单标对照品工作溶液进行子离子扫描，扫描范围50～600。设置不同碰撞电压，找出特征碎片离子最丰富的CE电压。另取混合对照品工作液，按优化后条件测定。

2.2.5 MRM

采用优化后的质谱条件，选取各化合物的特征子离子作为定性离子，设置离子对，进行多反应监测（MRM）的测定。

3 试验结果

3.1 高效液相色谱法

采用优化后的色谱条件进行11种药物混合标准溶液的分析,使用各药物单标进行定位,结果见图1 ,由图1可以看出，各峰峰形及分离度良好,说明采用优化后的色谱条件适合11种药物的同时分离，同时由表3可以看出各化合物的线性关系良好。

图1 11种化合物的HPLC图Fig.1 The HPLC figure of 11 kinds of compounds

精密度实验中，各药物峰面积RSD%为0.08%～0.23%，表明该方法精密度是良好的。稳定性实验中，随着测定时间的延长，各药物保留时间无明显变化，峰面积RSD%为0.12%～0.21%，表明在该方法测定条件下，测定结果是稳定的。各组分加标回收率结果见表4，可以看出11种化合物在本文试验条件下回收率良好，均接近100%，RSD%在0.6%～1.3%。

以信噪比为3计算检出限，结果为：那红地那非0.1 μg/mL，红地那非0.1 μg/mL，伐地那非0.1 μg/mL，羟基豪莫西地那非0.15 μg/mL，西地那非0.1 μg/mL，豪莫西地那非0.1 μg/mL，氨基他达拉非0.05 μg/mL，他达拉非0.05 μg/mL，硫代艾地那非0.05 μg/mL，伪伐地那非0.05 μg/mL，那莫西地那非0.05 μg/mL。由以上试验结果可以看出，采用本文中优化的方法可完全满足定性、定量的要求。

表3 各对照品线性方程Table 3 Linear equation of reference substance

表4 各组分加标回收率Table 4 Standard addition recovery of reference substance

表5 11种药物化合物质谱条件Table 5 Mass spectrometry conditions of 11 kinds of compounds

图2 11种化合物的MS图谱Fig.2 The MS figure of 11 kinds of compounds

3.2 液质连用法测定结果

通过对各物质单标对照品的测定,优化出最适质谱条件，结果见表5，采用表5的质谱条件对11药物的混合标准溶液进行分析，得到11种药物的全扫描图及相应物质的质谱图，结果见图2a，产生的特征子离子与文献资料一致[5]。 通过MRM的谱图（图2b）还可以看出，11种药物化合物分离度良好，基线噪音较小，通过与单标进行比对，其准确度高，由此可以看出该法分离效果好,准确度高,能同时进行11种药物测定。

通过本文建立的MRM方法对3批补肾胶囊进行检测，未检测出与11种化药成分相同的离子对，表明该补肾胶囊未非法添加此11种化学药品。

4 讨 论

采用国家食品药品监督管理局药品检验补充方案中的检验方法，11种化合物出现了峰形拖尾、分离度不好等情况。所以本文对其进行了优化。采用流动相代替甲醇对混合对照品进行稀释，调整梯度洗脱时间。通过对11种化合物单标进行母离子、子离子扫描得到最适质谱条件，且本法分离度好，质谱响应及准确性较高，符合定性定量的要求。

MRM方式是通过检测设定好的某类药物的特征离子对的方式来进行定性及定量检测的，与常规一级质谱相比，该法特异性高，受样品中其他物质的干扰小，能快速准确的筛查特定物质的存在与否，适用于保健食品中非法添加化药的监测检验工作。

［1］ 邢俊波,曹红,张炯,等.高效液相色谱法同时测定补肾壮阳类中成药及保健食品中非法添加7种化药成分[J].时珍国医国药,2014,25(2):451-453 .

［2］ 张建丽,王小兵.LC/MS和LC-MS/MS定性检测保健食品中非法添加的伐地那非[J].质谱学报,2009,30(4):219-222.

［3］ 张翠英,李振国,徐金玲,等.UPLC/MS/MS法检测补肾壮阳类中成药中非法添加枸橼酸西地那非的定性定量研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(10):1741-1742.

［4］ 高咏丽,邬晓鸥,肖丽和,等.HPLC-MS_MS法测定补肾壮阳类药品或保健品中非法添加羟基豪莫西地那非的研究[J].中成药,2009,31(7):1058-1061.

［5］ 李航,陈小泉,杜钢,等.保健食品中11种西地那非类药物的检测[J].生命科学仪器,2014,12(6):39-44.

工程塑料代替金属或将成为未来趋势

在各种塑料中，有的像石头一样坚硬，有的像钢一样坚韧，有的钢黄金一样安定。也有人认为，用工程塑料代替金属，产品质量要降低。事实是，用工程塑料代替金属在许多场合却提高了产品的质量。下面将工程塑料与金属进行比较，以使大家对工程塑料的性能有比较正确全面的认识。

工程塑料和金属相比，主要的优点有：

(1)制品质量轻：工程塑料的比重一般在0.83～2.2左右，只有钢铁的1/9～1/4，铝的1/2左右。有些工程塑料，例如聚丙烯等，比水还轻得多。塑料的这一特性，对要求减轻自重的机械装备，如车辆、船舶和飞机等，具有特别重要的意义。

(2)比强度高：对于等体积的材料来说，工程塑料的强度一般比金属要低些，然而由于工程塑料比金属要轻得多，因此以等重量相比时，则有些工程塑料的强度比一般金属高得多，是现有结构材料中强度最高的材料。例如，玻璃纤维增强的环氧树脂，它的单位重量的抗拉强度比一般钢材要高2倍左右。

(3)化学稳定性好：工程塑料一般对酸、碱等化学药品，均有良好的抗腐蚀能力，这是一个很显著的优点。其中聚四氟乙烯和聚氯醚具有非常突出的抗腐蚀能力，在用于化工防腐设备等方面有着广阔的发展前途。

Simultaneous Determination of 11 Kinds of Compositions Illegally Added in kidney healthy food by HPLC-MS/MS

ZHU Jie，HE Wei，MA Gui-juan
（Ningxia Food Testing Center, Ningxia Yinchuan 750004，China）

A method was established to determine 11 kinds of compositions illegally added in kidney healthy food by HPLC-MS/MS. HPLC was used to investigate the linear relationship, precision, stability and recovery rate. Scan, sim and product ion methods were used to optimize the MS parameters. The results show that the linear relationship, precision and stability are good（r≥0.999 9. The recovery rate of each group is 96.8%～100.5%. The separation of each group is good, and the MRM is accurate and fast. The method is suitable for qualitative and quantitative determination and rapid screening of the 11 kinds of compositions in kidney healthy food.

Healthy food; Illegally added; MRM; Rapid screening

O 657

： A

： 1671-0460（2015）11-2729-04

2015-09-02

朱捷（1988-），男，浙江湖州人，初级职称，硕士研究生，2013年毕业于西南科技大学植物学专业，从事食品检测工作。E-mail：zhujie_258@126.com。