血管生成三维培养模型的研究进展

任荣梅(综述),白　怀(审校)

(四川大学华西第二医院遗传代谢性疾病及围生医学实验室，成都 610041)

分子生物医学

血管生成三维培养模型的研究进展

任荣梅△(综述),白怀※(审校)

(四川大学华西第二医院遗传代谢性疾病及围生医学实验室，成都 610041)

血管生成或血管新生是指从已有血管长出新血管的过程。机体在生理状态，如胚胎发育、组织再生以及病理状态(如肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风湿关节炎等)均有血管新生。血管生成是内皮细胞的重要功能。传统单层细胞培养(2D培养)模型所取得的研究结果和体内的情况并不符合；动物模型的使用虽然具有其优点，但由于体内多种因素的制约以及体内和外界环境的相互影响,难以研究单一过程；三维培养(3D培养)模型可使细胞呈立体生长,更接近于体内自然生长状态，有利于研究细胞-细胞的相互作用，以及旁分泌对细胞的作用。血管生成3D培养系统的建立，已成为向着构建组织器官特异性3D血管生成模型目标迈进的关键环节。现对血管生成3D培养模型的研究进展进行综述。

13D培养与2D培养的比较

2D培养即在体外细胞单层培养，细胞呈片层样生长。利用2D培养，可以做一些基础的细胞生物学方面的研究，如细胞的形态结构以及细胞对环境理化刺激的应答反应等研究。然而，体内的细胞不像二维一样单层生长，如要研究细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用以及作用机制等用2D培养难以达到研究目的。

近几年3D培养技术在组织形成、血管发育和器官再造、肿瘤等领域得到了广泛的应用，同时在筛选新药的疗效分析和毒理实验等方面也显示出了重要的价值。

2生物材料

生物材料应具有天然组织的适应性，以利于细胞附着、存活、增殖和分化。多数3D培养模型均使用天然蛋白性材料，如Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白或富含层粘连蛋白膜性基质提取物，这些材料来源广泛并容易操作。此外，天然材料携带多种内源性信号，有利于细胞的存活，并且能有效地促进形态发生，如乳腺癌的形态发生[2]﹑内皮细胞毛细血管形态发生[3]和出芽[4]等。但天然蛋白3D支架也存在不足之处，如对其降解难以调控、机械稳定性不够，且存在产品批次间的差异等。近年来人们倾向于使用合成材料作为支架，其优点是易于进行化学修饰，也能很好地控制支架的化学成分和机械性能。

应用合成材料建立的3D肿瘤模型已有一些报道[5-7]。通过一定的配体交联方法和特定支架相配合获得的合成基质能控制支架硬度和黏附配体的浓度比例；合成支架的降解性可以人为控制达到需要的稳定性时间，这能通过在支架中引入特异的金属蛋白酶位点或特定性化学基团而实现[8]。此外，合成支架可以传递多种生长因子的活性，以介导细胞的命运[9]。但天然和合成支架均存在很高的含水量(高于90%)，而致其致密度偏低，为准确模拟肿瘤的外环境，致密程度更高的支架才能与抗肿瘤药物在体内生理性环境渗透特性相当[10]。

3培养分类

3D培养模型的种类较多，概括起来可以分为静态培养和动态培养两大类。

3.1静态培养3D静态培养的原理是将细胞直接接种于3D支架材料中，让其静止生长培养。细胞悬浮培养和球状聚集培养是其代表。

3.1.1静态细胞悬浮培养近年Nyga等[10]建立了胶原蛋白3D摸拟结肠癌血管新生模型，在含有人HT29结肠腺癌细胞的胶原蛋白基质中加入一定的可塑性材料，使胶原密度提高6倍，这种高密度胶原模拟组织的缺氧核心，在其外围非致密的胶原中种植人脐静脉内皮细胞和结肠成纤维细胞系CF56，经过21 d培养，中心处肿瘤细胞发展为缺氧肿瘤团块，而内皮细胞向内迁移到核心结构的外层。然而，该模型的缺点是形成的血管结构不明显，且外围非致密的胶原蛋白支架会发生收缩而出现分层。

Ingthorsson等[11]应用Matrigel支架研究了内皮细胞对人乳腺上皮细胞生长与分化的影响，发现内皮细胞刺激正常和肿瘤乳腺上皮细胞分化和克隆形成效能，其作用经可溶性因子介导。但在整个实验过程中内皮细胞仍保持圆形的静止状态，未见血管结构形成。该模型不适宜直接观察内皮细胞和上皮细胞的相互作用。

此外，Verbridge等[12]报道了口腔鳞癌细胞影响血管新生的胶原蛋白3D模型。这种模型是将内皮细胞种植于含肿瘤细胞的胶原蛋白表面，培养3 d后，内皮细胞向胶原中的肿瘤细胞方向侵入，提示肿瘤细胞对内皮细胞具有化学趋化作用。近年还发展出了双层生物工程化血管新生模型，该模型使用端粒酶永生化微血管内皮细胞，将其种植于Ⅰ型胶原水凝胶表面，水凝胶层之下为种植于Ⅰ型胶原内的MDA-MB-231或人乳腺癌细胞[13]。研究发现，两种细胞仅MDA-MB-231细胞能介导内皮细胞增殖并侵入到胶原蛋白层，形成复杂的网状毛细血管样结构。

尿白蛋白／尿肌酐与α1微球蛋白及C反应蛋白对早期糖尿病肾病的诊断价值…………………… 何云英 朱敏 蒋玲霞 等（1）117

3.1.2静态细胞球状聚集培养与常规的悬浮细胞培养和单层细胞培养相比，肿瘤细胞球状聚集培养可以复制原始组织的形态和功能特性[14-15]。肿瘤细胞在球状结构中的生长慢于单层培养细胞，在3D球状细胞结构中包含外增殖层、中静止层和内坏死细胞层3个区域。各区域肿瘤细胞的反应特性依肿瘤的大小而不同[14,16]。有研究利用厚层mitrigel，挖去其中一部分后，填入悬浮于Ⅰ型胶原的卵巢癌细胞，然后与培养基中含内皮细胞和肌成纤维细胞一起培养，48 h后培养基中的上述细胞围绕肿瘤细胞发生黏附和迁移，表面的细胞向肿瘤细胞处移动，形成管样结构，最后侵入肿瘤细胞簇；对肿瘤血管形成的分析发现，内皮细胞在侵入肿瘤细胞簇的过程中，肌成纤维细胞起支持作用。还有利用球状培养模型进行早期肿瘤血管新生的研究，即在胶原蛋白基质中培养内皮细胞、成纤维细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞，2 d后可见乳腺癌细胞促进毛细血管芽状结构形成[17]，这些芽状结构能对一些特定抗血管生成药物发生应答反应，该研究还发现基质细胞支持内皮细胞在血管生成过程中的侵入作用，提示临床前药物的筛选模型中应加入基质细胞。此外，另一项基于相同方法的研究模型，是利用脐静脉外植体和埋于Matrigel中的前列腺癌细胞聚集体的共培养[18]，培养20～25 d后可观察到肿瘤细胞簇刺激微血管外生，而不需添加外源性生长因子，此模型适用于筛选抗肿瘤药物，与小鼠主动脉环和常规细胞培养方法相比其敏感性更高。

为了克服基于细胞外基质来源的基质存在的固有缺陷，另一实验小组开发了半合成性starPEG-heparin水凝胶作为组织工程化材料，该系统具有可调控细胞微环境的特性，其机械性特征的变化与生长因子、黏附配体和可降解多态序列等生物性功能分子之间的关系可以人为加以控制，上述水凝胶与细胞外基质的相似之处在于可以同时附着和存贮多种生长因子，特别适用于肿瘤与血管生成关系的研究[19]。

3.2动态培养剪切力和血液流动在血管化过程和新生成的血管芽状结构的维持等方面起重要作用。微流体装置能模拟活体的微环境结构，可控制物质的运输和可溶性分子的时空传递，并能适时监控同类或异类细胞与细胞间的相互作用，因而优于传统的体外实验系统[20-21]。有研究小组制备了中心种植有内皮细胞的微流通道，其周围由含有MDA-MB-231细胞的Ⅰ型胶原所围绕[22]。通过施以肿瘤血管内相当的液体剪切力3 d，肿瘤细胞对与其共培养的内皮细胞产生应答反应，促血管生成基因的表达增加。

另外，Moya等[23]研发了另一种微流体模型，这种模型使用纤维蛋白或Ⅰ型胶原作为基质，其内种植有内皮集落形成细胞来源的内皮细胞，形成连续的微血管灌流网络，基质内同时含有共培养的结肠癌SW620细胞；该系统内可加入基质细胞，如正常人肺成纤维细胞[24]或ips-来源的心脏肌细胞[23]。

Shin等[25]和Chung等[26]研发了3D和2D相结合的微流体模型，应用该模型可研究空间和时间上细胞-细胞之间和细胞-细胞外基质之间的相互作用。Moll等[27]建立了用于外周神经髓鞘肿瘤研究的3D组织化肿瘤模型，该模型使用一段脱细胞的猪空肠段，在其顶端种植上原代成纤维细胞和S462肿瘤细胞，微血管内皮细胞种植于其底部和侧面，将种植有细胞的支架放置于流动的生物反应器中，使细胞暴露于剪切力14 d后，在组织学上观察不同细胞群的反应特性。这种支架的优点是保存有原血管结构，并能新种上血管内皮细胞，且保存有细胞外成分和结构。该模型有利于观察细胞黏附和组织分化。

总之，3D肿瘤动态血管新生模型能重现基本血管单位——毛细血管结构，以及一定程度的肿瘤生长。但该领域的研究尚处于初期阶段，未见有相关应用方面的研究报道。

4理想的培养模型

2005年来血管生成模型方面以肿瘤血管生成模型的研究进展尤为显著，虽然建立了很多新的复杂模型,但新模型尚有很多地方需要完善。理想的肿瘤血管生成模型应重现肿瘤的生理环境，即能对3D支架从生理、化学和生物学特性等方面加以控制，并能适时观察血管化过程中肿瘤微环境所发生的变化。要达到这些要求，以下方面尤为重要。

4.1材料不同类型肿瘤的基质成分在构成种类及其含量上均有不同[28]，构建肿瘤血管成生成模型因而具有相应的差别；此外，肿瘤基质成分在肿瘤发展过程中会发生由纤维蛋白样转变成胶原蛋白样的变化。在构建新肿瘤血管生成模型时还应考虑特定肿瘤微环境和血管生成过程相一致的环境。迄今多数3D模型均使用Ⅰ型胶原，其他天然材料，如透明质酸、茧丝和合成支架等已应用于血管仿生领域[29-30]，这些材料在3D培养血管生成模型中的应用有待探索。

4.2细胞种类肿瘤细胞微环境含有多种细胞，其构成细胞的种类依特定肿瘤类型的不同而不同。理想的模型应包括活体特定环境中所有的细胞种类。迄今多数3D肿瘤血管生成模型使用的细胞仅为肿瘤细胞和内皮细胞[11-13]。但很多研究均提示，间质成纤维细胞参与调节肿瘤侵入和血管生成，这类细胞应加入3D肿瘤血管生成模型中[17,31-32]。其他类型的细胞(如炎性细胞)加入到模型中，可以确定其在肿瘤血管生成中的作用。此外，来源于不同组织的内皮细胞在形态、标志分子的表达和代谢特性等均有不同[33]，还存在有与亲代肿瘤细胞相同的自发性突变等问题[34]，因而细胞来源在设计3D模型时也应加以考虑[35]。多数3D模型均使用的是永生化细胞株，未包含肿瘤干细胞或循环肿瘤细胞[36-37]，因此，在3D模型中应使用患者标本来源的原代肿瘤细胞，有利于研究其生长及长期存活。为增加实验模型所获结果的预见性效力，使用患者自体来源的细胞以用于个性化的药物试验将是未来努力的方向。

4.3结构特性实体肿瘤组织的结构为由基质围绕肿瘤实质所构成[38]。肿瘤的结构依赖于肿瘤类型及其进展阶段有所不同。目前多数3D模型仍然采用随机方式将细胞种植于基质内。通过3D微图形成型技术、光刻技术和微形打印技术[39]等方式可以获得期望的细胞空间排列的结构。这些新方法的使用有助于达到自由控制不同细胞群与群之间的距离以及相互作用类型的目的，同时在时空上给予生物化学和生物物理性刺激[20]。

4.4培养条件传统的3D血管新生模型一般是静态模型，近年在此基础上发展出了组织工程化动态微流模型，该模型已开始用于肿瘤研究。理想的肿瘤血管生成3D模型应包括模拟血流的动态成分，因为活体状态内皮细胞连续地暴露于剪切刀和组织间液的流动，循环系统对抗肿瘤药物的运输是通过组织间液的流动而实现，且液体的流动能产生可溶性因子的浓度递变幅度[40]。目前对添加可溶性因子(如血管内皮生长因子)在肿瘤血管生成研究领域的使用目前还存在争论。此外，长期3D培养对细胞活性的维持也是一个问题，高细胞密度的培养要求研制新的装置以克服氧产生的不足或代谢废物的积聚。

4.5分析方法目前对多数3D模型实验结果的分析仍采用描述性的方法，如常规的显微分析法及共聚焦显微分析法等[41]。将来期望从实验结果中获取更多的数据用于分析。进一步建立高解析力的4D显微分析技术，有助于对肿瘤环境中血管生成事件加以详细的记录；对肿瘤细胞募集、细胞间相互作用和刺激新的血管结构形成等动态性观察会增进人们对肿瘤血管生成的深入理解。开发3D和4D显微成像获取数据的自动分析系统，有助于避免结果的偏差，并简化和加速数据的分析过程。此外，为更详细记录3D肿瘤模型的影像，还必须建立稳定的荧光蛋白表达细胞系(如肿瘤细胞、内皮细胞和其他细胞系)，并克服现在使用的细胞示踪分子稳定性较低及存在毒性的问题。

5结语

2005年来3D组织工程领域取得了很大的进展，已研究出一些新的能控制生化和生物物理特性用于血管生成模型研究的新方法。已有的3D肿瘤血管生成模型虽然包含有细胞和无细胞成分，但并未能完全模拟肿瘤微环境的异质性。新一代3D血管生成模型应更加注重生理上精确模拟活体组织的特性，以获得准确的实验结果。研发新的3D培养模型有助于增进对肿瘤血管生成机制的理解以及提高抗肿瘤药物的开发效率。

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摘要：血管生成是内皮细胞的重要功能，在胚胎发育、组织再生、炎症﹑肿瘤的生长与转移等多种生理和病理过程均有血管生成。传统的单层细胞培养(2D培养)模型是迄今最常用的体外实验研究模型，但存在诸多的不足，如细胞的生长特性与体内差异较大等。三维培养(3D培养)模型上细胞呈立体生长,更接近于体内的自然生长状态。3D培养已经发展出了多种方法，特别是近年组织工程技术的应用，3D血管生成模型的建立取得了很多新进展，在肿瘤领域的相关研究尤为活跃。

关键词：血管内皮细胞；血管生成；三维培养

Recent Advances in Three-dimensional Models of AngiogenesisRENRong-mei，BAIHuai.(LaboratoryofGeneticMetabolicDiseaseandPerinatalMedicine,SichuanUniversityWestChinaSecondHospital,Chengdu610041,China)

Abstract:Angiogenesis is an important function of endothelial cells,which participates in physiological and pathological processes,such as embryo development，tissue regeneration,inflammation,tumor growth and metastasis.Monolayer(two-dimensional,2D) cell culture models are the traditional culture models widely used for in vitro experimental cell research.However,these models have several drawbacks,such as cell growing differs greatly from naturally grown cells.Cells growing in three-dimensional(3D) matrix is closer to growth in vivo.In recent years 3D culture has developed a variety of novel methods,especially in combination with utilizing tissue engineering technology.A lot of progress has been achieved in 3D in vitro angiogenesis model,especially in the tumor research field.

Key words:Vascular endothelial cells; Angiogenesis; Three-dimensional culture

收稿日期：2014-11-03修回日期：2015-01-19编辑：相丹峰

基金项目：国家自然科学基金(81271733)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.16.001

中图分类号：R363

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)16-2881-04