降尿酸药物筛选方法学研究进展

张 雪，俸婷婷，黄俊飞，乔 杨，周 英*

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中药民族药创制工程中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州 贵阳 550025)



降尿酸药物筛选方法学研究进展

张 雪1,2,3，俸婷婷1,2,3，黄俊飞1,2,3，乔 杨1,2,3，周 英1,2,3*

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中药民族药创制工程中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省药食同源植物资源研究开发中心，贵州 贵阳 550025)

降尿酸药物的筛选方法分为体内和体外筛选两种。体内筛选方法是建立高尿酸血症动物模型，体外筛选方法是建立肾小管上皮细胞模型和体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。目前体内动物模型筛选方法研究比较成熟，已有诸多文献报道，体外酶抑制剂和细胞水平筛选尚需进一步探索研究。总结降尿酸药物体内外筛选方法，为新药开发利用提供参考依据。

降尿酸药物；高尿酸血症；肾小管上皮细胞；黄嘌呤氧化酶

尿酸是人体内嘌呤代谢的终产物。人体内80%尿酸是在体内合成，或由次黄嘌呤、黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶(XO)的作用下分解代谢产生，20%尿酸由摄入食物中的核蛋白或嘌呤分解代谢产生。尿酸主要经肾脏排泄，以原形经肾小球滤过进入肾小管，经过肾小管重吸收和再分泌，最后进入集合管，经泌尿系统排出体外。当嘌呤代谢异常或肾小管对尿酸的重吸收增加时，人体内的尿酸总量会升高，引发一系列病症。

人体内血尿酸含量正常值为1 200mg，当血尿酸含量超过正常范围时，易导致高尿酸血症，损害肾脏功能；当血尿酸浓度过高时，易在关节部位形成结晶沉淀，导致关节肿胀和疼痛而引发痛风。此外，高尿酸血症与血糖、血脂代谢密切相关，是引发动脉粥样硬化、冠心病和高血压的危险因素，是冠心病患者死亡的独立预警因子，在糖尿病及其并发症发生和发展中起到重要作用[1]。

根据尿酸产生与排泄的机制，降尿酸的途径主要包括减少尿酸生成、增加尿酸排泄、抑制尿酸重吸收。降尿酸药物可通过建立高尿酸血症动物模型进行体内筛选，或建立肾小管上皮细胞(RTEC)模型进行体外筛选，还可直接在体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。本文主要对降尿酸药物的体内和体外筛选方法进行综述，为治痛风新药的研发提供参考依据。

1 降尿酸药物体内筛选方法

降尿酸药物的体内筛选方法为建立高尿酸血症动物模型，造模方法主要分为以下三种[2]：①直接摄入尿酸、高嘌呤食物或尿酸前体物质，增加黄嘌呤氧化酶活性，促进尿酸产生，形成高尿酸血症模型；②通过给药抑制尿酸排泄，增加血尿酸浓度，形成高尿酸血症，常用药物为腺嘌呤、烟酸等；③抑制尿酸酶活性。尿酸酶可氧化分解成尿酸，通过抑制或消除尿酸酶活性可增加血尿酸浓度，常用尿酸酶抑制剂为氧嗪酸。此外，还可利用基因工程技术，破坏小鼠尿酸酶基因，获得尿酸酶缺乏的突变型小鼠高尿酸血症模型[3]。

高尿酸血症通常会伴有其他合并症，引发一系列继发性损伤，如糖脂代谢紊乱、痛风、肾损伤及心血管疾病。因此，高尿酸血症动物模型可分为单纯性高尿酸血症模型和伴继发性损伤或合并症的高尿酸血症模型。

1.1 单纯性高尿酸血症动物模型

单纯性高尿酸血症常用造模动物为大鼠、小鼠。杨桂梅等[4]灌胃给予大鼠氧嗪酸，大鼠体内尿酸含量明显升高，且维持时间较长，无肾功能损害。张培等[5]灌胃给予大鼠高酵母饲料及腺嘌呤溶液，皮下注射氧嗪酸乳悬液，获得慢性高尿酸血症模型，该模型稳定、血尿酸含量高、维持时间长。董静[6]连续灌胃给予小鼠酵母膏和乙胺丁醇3周，获得持久稳定的高尿酸血症模型。

1.2 伴继发性损伤或合并症的高尿酸血症动物模型

伴继发性损伤或合并症的高尿酸血症模型常用动物为大鼠、小鼠、鸡及鹌鹑。Stavric等[7]以氧嗪酸、尿酸混合饲料喂养大鼠，使其血尿酸含量升高，肾脏内出现明显的尿酸盐结晶沉积、肾小管间质纤维化及尿酸性梗阻型肾病。迪丽达尔·希力甫等[8]腹腔注射给予大鼠酵母膏和氧嗪酸，使其尿酸维持高浓度水平，且大鼠肾脏、心脏及动脉发生形态和病理改变，是研究高尿酸血症引起继发性心血管病理损伤的良好模型。高碧珍等[9]以高糖、高脂饲料饲养大鼠，以腺嘌呤灌胃，可复制高尿酸血症合并糖脂代谢紊乱模型。 匡红艳[10]采用高蛋白质、高钙饲料饲喂鸡并限水，鸡的跗踝周径明显增大，获得高尿酸痛风性关节炎动物模型。杨红莲等[11]采用尿酸、腺素混合饲料喂饲鹌鹑，获得持续稳定的高尿酸血症模型，随着造模时间的延长，鹌鹑还伴发有糖、脂代谢紊乱，肝、肾功能损伤等病理表现。

2 降尿酸药物体外筛选方法

降尿酸药物的体外筛选方法为建立肾小管上皮细胞模型，还可直接在体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。尿酸进入肾脏后，经肾小管上皮细胞顶模进入上皮细胞，再经细胞的基底膜进入肾小管周围的毛细血管，进而回到体液中，当尿酸重吸收量增大时，血浆中尿酸浓度便会升高。因此，通过建立肾小管上皮细胞(RTEC)模型，考察体外测定药物对RTEC尿酸重吸收功能的影响，可筛选出降尿酸药物。黄嘌呤氧化酶(XO)在尿酸生成过程中具有重要作用，其可催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进而生成尿酸，XO还可直接催化黄嘌呤生成尿酸。因此，可在体外测定药物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，筛选降尿酸药物。

2.1 肾小管上皮细胞模型

RTEC模型的建立可分为原代分离培养和细胞株培养两种，各有优缺点。原代分离的RTEC形态和特征保留完整，生物性状变化不大，更接近体内状态，具有较好的特异性，且其分化程度高，稳定性强，是体外研究RTEC对尿酸吸收功能的最佳选择。但原代分离的RTEC中杂细胞多，细胞纯度不高，且原代分离的RTEC高度分化，仅能传2～3代，需重复分离。细胞株的培养可无限增殖和传代，但功能特征与体内原始状态差异较大，其尿酸吸收功能有一定改变，在筛选降尿酸药物时具有一定的限制性。原代分离RTEC的介质主要为人、大鼠、小鼠和兔肾脏，通过酶消化法获取肾小管节段进行组织培养，进而获取RTEC。肾小管节段的纯化可采用细胞筛机械分离，或者percoll分离液梯度离心分离，也可两者联用。

臧路平等[12]取小鼠肾脏，切取肾皮质剪碎研磨，采用Ⅰ型胶原酶消化，依次过50目、100目筛网，Per coll密度梯度离心分离肾小管节段进行培养，获得小鼠RTEC。然后采用分离的细胞进行尿酸吸收功能测试，验证了该模型可用于体外筛选降尿酸药物。严玉澄[13]取正常人肾皮质的组织块，采用无血清培养液直接培养，获得了人近端肾小管上皮细胞。

RTEC可自发性或诱发性转变为永生化细胞株，使用SV40病毒可有效诱导RTEC无限增殖[14]。目前实验室已获得了高度专一的肾小管上皮细胞株，包括近曲肾小管细胞、髓袢升支细胞等[15]。

2.2 黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选

XO可催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化生成尿酸，并产生氧自由基，因此抑制XO活性即可达到降尿酸效果。在体外测定药物对XO活性的影响，即可筛选XO抑制剂。XO活性的测定方法主要为紫外分光光度法，吸光度值越大，XO活性越高。此外，也可在反应体系中加入氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，NBT可与氧自由基产生紫色的甲臜，通过测定甲臜的吸光度可反映XO的活性。体外筛选XO抑制剂时，需考虑待测样品的吸光度干扰，设置空白对照实验。

朱深银等[16]建立了XO抑制剂的高通量筛选模型，并筛选了71 760个化合物和初提物。黎莉等[17]利用体外XO抑制剂筛选方法，发现枳椇子乙醇提取物、高良姜乙醇提取物和葛花乙酸乙酯提取物对XO具有较强的抑制活性。

3 结语

尿酸水平升高可引发痛风、肾功能损伤、心血管疾病及代谢综合征等。随着生活水平的提高，高尿酸血症的发病率呈上升趋势，因此筛选降尿酸药物对高尿酸血症的防治至关重要。

降尿酸药物的筛选分为体内和体外两种。体内筛选是建立高尿酸血症动物模型，给药后进一步筛选出具有降尿酸作用的药物。体外筛选是建立肾小管上皮细胞模型和体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。肾小管上皮细胞模型的建立可选择原代分离和细胞株培养，该模型药物作用靶点精准，数据直观。黄嘌呤氧化酶抑制剂的体外筛选具有效率高、灵敏性好、作用准确等优点。

与体内筛选方法相比，降尿酸药物的体外筛选具有明显的局限性，不能充分反映药物的药理作用以及机体对药物的吸收代谢过程。但体外筛选方法可在细胞和分子水平上进行降尿酸药物的筛选，具有高效、灵敏、准确、经济等特点，特别适合高通量药物的筛选。随着体外筛选模型评价标准的发展以及新药作用靶点的研究发掘，筛选模型将更加具有新颖性和实用性，将成为新药开发的一个重要研究方向。

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(责任编辑：尹晨茹)

2014-11-26

贵州大学引进人才科研项目(贵大人基合字(2012)010号)；贵州省国际科技合作计划项目(黔科合外G字[2013]7009号)；贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2012]2173号)；贵阳市科技计划项目2012现代药业计划(筑科合同[2012204]9号)；贵州省药食同源植物资源研究开发中心(黔科合G字[2014]4003号)；贵州大学研究生创新基金(研农2015020)

张雪(1990-)，女，贵州大学硕士研究生，研究方向为天然药物活性成分及药理作用。

周英(1971-)，女，博士，贵州大学教授，博士生导师，研究方向为中药新药研发。

R965.1

A

1673-2197(2015)06-0048-02

10.11954/ytctyy.201506021