生存因子Netrin-1对胰岛的作用

刘晨霄(综述),李　倩(审校)

(南京医科大学附属南京医院内分泌科,南京210006)

生存因子Netrin-1对胰岛的作用

刘晨霄△(综述),李倩※(审校)

(南京医科大学附属南京医院内分泌科,南京210006)

摘要：生存因子 Netrin-1在神经和血管的新生过程中均发挥重要作用。最近的研究发现，在胰岛形成过程中，Netrin-1能通过激活整合素调节细胞的迁移、侵袭、增殖和生存，并具有和血管内皮生长因子一样的促进血管生成的功能，刺激平滑肌细胞和内皮细胞有丝分裂。同时，Netrin-1能够在新生的胰岛中表达，并参与调节凋亡，保护胰腺损伤。生存因子Netrin-1对保存胰岛细胞量及修复胰岛功能提供新思路，对2型糖尿病的预防和治疗具有深远的意义。

关键词：生存因子 Netrin-1； 2型糖尿病；胰岛；细胞凋亡

糖尿病在全球呈上升趋势，严重威胁人类健康。目前研究认为胰岛β细胞分泌胰岛素不足在2型糖尿病发生、发展中起重要作用，胰岛素分泌能力取决于β细胞的数量和β细胞的功能，胰岛β细胞量减少是造成胰岛素分泌能力绝对下降的重要因素，β细胞量减少在2型糖尿病的发病机制起着重要的作用[1]。研究表明，生存因子Netrin-1在胰腺发育过程中能促进胰岛细胞及胰周血管新生[2]，避免炎性因子损害[3-7]。为糖尿病的预防和治疗提供新的思路，现综述Netrin-1 对胰岛的作用。

1Netrin-1及其受体

Netrins是最早发现的可溶性轴突导向因子，是一类结构高度保守且与层粘连蛋白相关的蛋白质，Netrins的发现可以追溯到20世纪末圣地亚哥研究者提出的理论[8]，随后有研究者从体外胶原凝胶中证明神经管能分泌一类特异性吸引轴突向底板方向生长的蛋白质,随后研究者在秀丽线虫(c．elegans)中发现神经导向基因,其中一个是UNC-6，编码分泌性蛋白，与层粘连蛋白有序列同源性[9]。已证实有3种分泌型 Netrin 蛋白：Netrin-1、Netrin-3、Netrin-4 (也称为 β-Netrin)，还有两种位于细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚 Netrins家族成员：NetrinG1和NetrinG2[10]。分泌型 Netrins 与其单链跨膜受体结合发挥作用[11]。其5个受体包括：结肠癌缺失基因 (deleted in colorectal carcinoma,DCC) 及其类似物 neogenin、UNC-5 同源物、唐氏综合征细胞黏附分子[10]和腺苷 A2b 受体(adenosine 2b receptor，A2b)[12]。

Netrins最重要的功能是在神经系统发育过程中起双相轴突导向作用——吸引或排斥[13]，目前对 Netrins中Netrin-1 的功能和表达研究最多[14]。近年来发现，Netrins及其受体在非神经组织中也广泛表达并发挥重要作用，已证实 Netrin-1 可以影响乳腺的发育[15]、调节肺形态形成、保护心脏对缺血/再灌注损伤[16]等。同时作为生存因子，Netrin-1可能在血管形成的过程中起着内皮导向因子的作用。

2Netrin-1及其受体在胰腺的表达

Netrin-1在胰腺上表达。Yang等[17]证实在成年大鼠的胰腺上可以表达Netrin-1的所有基因，并且在成年大鼠及人体胰腺上发现其受体，近年研究结果也提示胰岛除了表达和分泌经典的激素外，还分泌Netrin-1[18]。

Breuck等[18]建立妊娠大鼠模型，经过Western blot分析证实，在幼鼠脑组织中 Netrin-1 抗血清在大约Mr 78区域呈现一蛋白条带，并观察在幼鼠胰腺组织中E20附近也有同样的蛋白条带表达，但是在E21区域蛋白条带很模糊，成体鼠胰腺组织中检测不到 Netrin-1蛋白。结扎成体大鼠的胰腺管，在结扎后的第 3、5、7 日分别观察发现在部分胰腺上Netrin-1 蛋白重新表达，特别是在腺管结扎后的第5日表达量明显增加。经逆转录-聚合酶链反应证明， Netrin-1 mRNA存在于所有胰腺组织中，并且所有类型的胰腺上皮细胞均可以合成 Netrin-1。

人的胰岛分泌 Netrin-1 并不依赖于高血糖的刺激，胰岛分泌的胰岛素和 Netrin-1 均储存于特定的分泌囊泡中,这一过程依赖α细胞和β细胞上的 Netrin-1 受体 (Neogenin,UNC5A 和 UNC5B)。

3Netrin-1 促进胰岛组织形成和胰周血管新生

3.1Netrin-1促进胰岛组织形成 胰腺的上皮细胞(内分泌部和外分泌部)由原始肠上皮细胞分化形成。这个过程首先始于脊索与内胚层的中线直接接触，导致背芽(胎龄8.5 d；大鼠第13 体节)和腹芽(胎龄10.5 d；第30 体节)外翻。胰腺上皮细胞(两种胰腺原基)与间质组织分泌的细胞外基质、生长因子和其他信号分子的相互作用，引起了细胞增殖、胰腺形态发生以及胰腺内分泌细胞和外分泌细胞分化的高峰。研究提示Netrin-1或许在胰腺形态形成及细胞迁移方面发挥了作用[19]。在发育中的胰腺上，Netrin-1 是由导管内未分化的上皮细胞、胰岛及腺泡表达。分泌的Netrin-1结合在基膜细胞外基质上，促进胰腺上皮细胞黏附和胰腺前体细胞的迁移。

研究发现Netrin-1在大鼠妊娠末期即胰岛形态形成的关键时期表达，在新生大鼠和成年大鼠体内检测不到其蛋白表达。然而，在胰腺损伤模型(结扎胰管)中胰岛再生及胰腺组织重塑，伴随着Netrin-1表达，免疫组织化学也进一步证实其在再生胰腺组织上呈高表达，在正常胰腺组织中呈阴性，提示其机制是由于Netrin-1促进上皮细胞从外分泌组织向内分泌组织迁移，但目前对上皮细胞迁移能力及其分子调节机制研究尚不成熟。进一步探索Netrin-1对体外胰腺上皮细胞迁移的影响，在共培养的Transwell 小室中加入10×103pg/L Netrin-1，结果较对照组发生迁移的细胞数明显增加，并且细胞迁移能力与Netrin-1的剂量存在一定相关性[18]。

探索Netrin-1通过何种受体黏附于发育中的胰腺上皮细胞,研究者发现了一个有趣的现象: 胰腺上皮细胞需依赖受体DCC黏附在 Netrin-1 的 Ⅴ、Ⅵ的结构域上，进而维持脊索上联合轴突的生长和其定向性。但是胰腺上皮细胞却可以直接黏附在 Netrin-1 C端来源的肽段上，已经证实这个结构域也可以与肝素结合，并且可能参与了Netrin-1与细胞外基质结合的过程[20]。

α6β4与层粘连蛋白或 Netrin-1 结合后，通过酪氨酸激酶家族激酶引起β4亚基异常大的胞质尾端磷酸化，进而激活信号通路[涉及到Src同源结构域连接蛋白募集、肾素-血管紧张素系统活化和丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶磷酸化]，调节细胞迁移、侵袭性、细胞增殖和生存。在胰腺上皮细胞上，α6β4是唯一与 Netrin-1 黏附的整合素受体，这提示，这种相互作用在胰腺发育过程中可能发挥了重要的信号功能。

3.2Netrin-1 促进胰周血管新生Netrin-1对血管新生起反馈调节作用。研究者认为Netrin-1在胰腺周围血管新生与上皮细胞迁移、黏附过程中发挥促生存因子的作用[21]。

Netrin-1 通过其定植在毛细血管上的受体 UNC5b 在血管形成过程中发挥排斥性作用，在 UNC5b 受体功能缺失的突变鼠体内，观察到了过度分支的血管、过度扩展丝状伪足的内皮细胞，使用动脉内皮细胞培养系统表达 UNC5b，研究者发现扩展丝状伪足的内皮细胞减少，在敲除Netrin-1 同源物(反义寡核苷酸诱导)的斑马鱼新生血管中也发现类似的异常分支[22]。因此，认为 Netrin-1-UNC5b 途径或许在胚胎发育期通过限制内皮细胞丝状伪足过度扩展调节血管生成。同时，Netrin-1 与细胞外环境的其他成分(如细胞外基质和生长因子等)相互作用从而确保血管有序延伸、生长。

采用斑马鱼或哺乳动物模型，功能获得或敲除相关基因，通过离体和在体试验都得出了相同的结论：Netrin-1是一种促血管生成的因子。并通过阻断小鼠髂动脉造成后肢缺血模型[23]，发现 Netrin-1 有和血管内皮生长因子一样的促进血管生成的功能，增加新生血管中平滑肌细胞向内膜聚集，但这种血管生成的影响可能在胚胎期和新生内皮细胞中及体内和体外不同条件下存在差异性。而在糖尿病模型中，Netrin-1能促进内皮细胞的增殖，增加神经周围血管密度，提高神经传导速度，此外，还能刺激施万细胞的增殖；与血管内皮生长因子相比，Netrin-1 更能提高神经传导速度，提示其神经、血管双重功效在糖尿病中潜在的治疗优势。最近，Tu等[24]提出内皮细胞跨膜蛋白的免疫球蛋白超家族成员CD146也是Netrin-1受体，Netrin-1能通过与其结合促进血管新生。胰周血管为胰腺及胰岛组织提供营养，Netrin-1 是否参与胰周血管的形成发育尚无足够依据，前仅有少量的文献报道 Netrin-1 在胰腺再生及与胰腺血管的作用。

4Netrin-1 抑制 β细胞凋亡

高血糖导致胰腺细胞凋亡,并使胰岛移植产生困难。在缺乏Netrin-1时，UNC5H2 和 DCC 表达上调将导致凋亡细胞增多；当外源性 Netrin-1与UNC5H2 或 DCC 结合后，这种作用被抑制。随后，他们证实 UNC5H2 和 DCC均是胱天蛋白酶3 (caspase-3) 的基质，UNC5H2和DCC的胞质内序列(特别是UNC5H1,UNC5H2 和 UNC5H30)是已知的“亡构造域”，能募集并激活caspase-9，在胰岛β细胞中，caspase-9 是凋亡中的启动和效应胱天蛋白[25]，继而进一步激活caspase-3。UNC5H促凋亡可能是通过依赖丝氨酸/苏氨酸激酶的死亡相关蛋白激酶和色素瘤相关抗原家族的同系物蛋白来激活caspase级联反应的凋亡过程。最近，有研究发现DCC调节细胞凋亡可能与脂质的棕榈酰化和再分配相关，但具体机制尚不清楚。

也有研究表明，Netrin-1及其受体表达受p53的直接调节，其中，Netrin-1受体基因UNC5H2已被鉴定为p53的靶基因，并被命名为p53RDL[26]。UNC5基因在不同的转化细胞表达导致培养基中细胞生长受到明显抑制，减少基膜基质的浸润，诱导凋亡，而加入Netrin-1后这些效应消失。Yang 等[17]认为，Netrin-1 及其受体的表达水平似乎存在一种年龄相关性，这种表达提示在胰腺内存在 Netrin-1 的自分泌或旁分泌路径，Netrin-1过表达导致 neogenin 蛋白下调表明胰岛内有 Netrin-1 自分泌信号存在。neogenin和UNC5与Netrin-1结合后，降低了caspase-3的活性，特别是在高糖环境下这种作用更为明显[27]，这与之前证实 Netrin-1对其他细胞如胃上皮细胞，神经上皮细胞及乳腺细胞具有促活作用是一致的[28]，并且Yang 等[17]认为这种凋亡作用与下游的信号通路Akt、ERK、ASK1相关。

5Netrin-1 抑制炎性因子对胰腺的损伤

最近在体内和体外试验中，研究者发现 Netrin-1 似乎具有抑制白细胞从上皮细胞游出的作用，因此可以控制炎症，此外，在一些动物模型上也表明其可以调节炎症反应，减轻局部组织损伤，包括急性结肠炎[3-5]、急性肺损伤、腹膜炎[3,6]及顺铂诱导的肾脏损伤[7]等，提示在胰腺炎症中 Netrin-1 也可以发挥类似的保护作用。

Chen等[27]在急性胰腺炎模型(精氨酸诱导)，观测到Netrin-1 组较对照组体内中性粒细胞渗出明显减少，血浆炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素(interleukin,IL)1β、IL-6 水平下降，而IL-10 水平明显升高，淀粉酶水平及髓过氧化物酶活性降低，受损伤的胰腺组织得到改善。现认为，UNC5b 或者腺苷 A2b 受体信号通路参与抑制白细胞聚集和炎症反应[29]，已证实UNC5在多种白细胞簇上表达，这种受体能抑制粒细胞和淋巴细胞迁移[30]，腺苷 A2b抑制中性粒细胞向体内、外迁移[31]。值得注意的是，Bhama等[32]发现在肥胖的人体及大鼠内的Netrin-1只选择性地在内脏白脂肪中增加，其在血清中并不改变，与瘦的个体相比循环中的Netrin-1也只是中度下降，白脂肪中的炎症涉及到IL-6聚集、脂解率和肝葡萄糖生成增加[33]。减少循环中的Netrin-1能够调节肾脏缺血/再灌注过程中的炎症反应[29,34]，并且上皮细胞过表达Netrin-1能够降低低密度脂蛋白受体缺失小鼠发生动脉粥样硬化的风险[35]。Moore 等[11]认为Netrin-1通过激活环腺苷酸通路，活化反应结合蛋白，继而抑制免疫细胞产生炎性因子。Netrin-1 调节炎症反应涉及到过氧化物酶体增殖物活化受体，各种类型的脂肪酸花生四烯酸的代谢产物可以绑定并激活过氧化物酶体增殖物活化受体[36]，Netrin-1与其结合促进巨噬细胞极化状态向选择性活化的M2表型转化[37]，发挥抗炎、保护组织损伤的作用，并抑制干扰素γ诱导巨噬细胞表型经典活化的M1型活化，减少循环中炎性介质IL-6、IL-10等的释放[36]，同时通过抑制核转录因子抑制蛋白降解，阻止核因子κB通路活化，核因子κB是已知的环加氧酶通路调节器，调节环加氧酶2的表达、前列腺素E2的产生[38]，核因子κB可促进多种细胞因子的基因转录[39]，数据表明核因子κB激活会下调炎症时Netrin-1的表达，但外源性的 Netrin-1 不会抑制核因子κB的表达[38]，要进一步阐明炎症时 Netrin-1 与 核因子κB之间的关系尚需要从除了表达水平以外的多方面进一步研究。

6展望

Netrin-1作为一种新的生存因子，在血管和神经的发生、发育中起着重要作用，其受体在胚胎期和损伤后的胰岛中均广泛表达，并能调控胰岛部位的炎性因子的作用。但是，迄今为止还有许多问题尚待解决，特别是Netrin-1如何影响胰岛细胞量，其作用通过何种机制起作用等。这些需要再进一步研究，将为糖尿病发病机制提供新的理论依据，同时为糖尿病的预防和治疗提供新的策略，对人类战胜糖尿病具有深远的意义。

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The Effect of Survival Factor Netrin-1 on Islet

LIUChen-xiao,LIQian.

(DepartmentofEndocrinology,NanjingHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210006,China)

Abstract：Netrin-1,a survival factor,plays a major role in the development of neurogenesis and angiogenesis.Recent studies have shown that Netrin-1 transduced through the activation of a6β4 integrin regulating cell migration and invasiveness,cell proliferation during islet formation.Netrin-1 is also involved in promoting angiogenesis like vascular endothelial growth factor,stimulating mitogenesis of vascular smooth muscle and endothelial cell lines.At the same time,Netrin-1 can activate islet neogenesis,modulate cell apoptosis and protect the pancreas from injury.Survival factor Netrin-1 has significant role in preserving islet mass and repairing pancreatic cells,which provides a novel avenue for prevention and treatment of type 2 diabetes mellitus.

Key words：Netrin-1; Type 2 diabetes mellitus; Pancreas islet; Apoptosis

收稿日期：2015-03-24修回日期：2015-05-22编辑：相丹峰

基金项目：国家自然科学基金(81200594)；南京市医学科技发展项目(ZKX14037)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.005

中图分类号：R587.1

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)23-4236-04