内生真菌对花生残茬腐解及土壤酚酸含量的影响

谢星光, 戴传超, 苏春沦, 周佳宇, 王宏伟, 王兴祥

1 南京师范大学生命科学学院, 江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心, 江苏省微生物与功能基因组学重点实验室, 南京 210023 2 中国科学院土壤环境与修复重点实验室(南京土壤研究所), 南京 210008 3 中国科学院红壤生态实验站, 江西省红壤生态研究重点实验室, 鹰潭 335211

内生真菌对花生残茬腐解及土壤酚酸含量的影响

谢星光1, 戴传超1, 苏春沦1, 周佳宇1, 王宏伟1, 王兴祥2,3,*

1 南京师范大学生命科学学院, 江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心, 江苏省微生物与功能基因组学重点实验室, 南京 210023 2 中国科学院土壤环境与修复重点实验室(南京土壤研究所), 南京 210008 3 中国科学院红壤生态实验站, 江西省红壤生态研究重点实验室, 鹰潭 335211

土壤中花生残茬是导致连作障碍的原因之一。为了探讨施加内生真菌Phomopsisliquidambari(B3)对加速花生残茬腐解、改善连作花生土壤环境、缓解花生连作障碍的作用及其可能机理，通过向土壤中添加花生(Archishypogaea)残体，利用盆栽试验探讨了施加B3对花生残茬腐解率、土壤部分酚酸物质和酶活性的影响。结果表明：与CK相比，在萌发期和苗期，添加B3处理显著加快残茬腐解，提高纤维素木质素降解率，增加土壤中对羟基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量；在花生整个生育期，施加B3显著调节了土壤中漆酶、锰过氧化物酶(Manganese peroxidase, MnP)、木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性的动态变化，这种变化有利于花生残茬快速腐解和酚酸类化感物质的及时转化。开花期之后施加B3处理土壤酚酸含量显著降低，花生荚果增产19.9%。实时定量PCR结果表明内生真菌B3在土壤中30 d内可以被检测，并对复杂多样的酚酸类物质具有广谱高效的降解能力。由此说明，施加内生真菌B3可以显著加快连作土壤中花生残茬腐解，进而通过减少土壤酚酸含量来缓解由残茬腐解引起的连作障碍。

花生残茬; 连作障碍; 酚酸; 内生真菌; 土壤酶活

花生是我国重要的油料作物，2011年我国花生播种面积450多万hm2，约占油料作物总面积的35%[1]。由于长期连作，花生连作障碍比较普遍[2]。导致花生连作障碍的因素多种多样[3- 5]，其中前茬花生残体及其腐解物往往造成土壤功能和特性下降[6]、微生物区系失衡[7]、影响种子萌发和幼苗生长[8- 9]以及土传病原菌增加等往往是抑制花生生长的主要因素[2,10- 11]。土壤酚酸类化感物质积累是作物残茬腐解产生连作障碍的直接原因，主要通过影响植物细胞膜通透性[12]、矿质元素吸收[13]、光合作用[14]及蛋白质和DNA合成[15]等多种途径直接抑制作物生长。

内生真菌是指生长于植物组织细胞间，宿主不表现出感染症状的一类真菌[16]。前期发现，接种内生真菌Phomopsisliquidambari(B3)15 d后，秸秆表面出现空洞和缝隙以及入侵到秸秆表面的B3菌体，木质素的阻碍被去除从而显著增强还田秸秆降解[17- 18]。B3在促进茅苍术(Atractylodeslancea)凋落物快速降解的初期阶段还加快了4-羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, 4-HBA)、香草酸(Vanillic acid, VA)和香豆酸(p-Coumaric acid,p-CA)的释放[19]；连作花生土壤中施加内生真菌B3可以显著提高花生产量、增加花生根瘤数及改善土壤微生态环境[20]。但连作土壤施加内生真菌B3后花生增产与秸秆腐解之间有无关系仍不清楚。因此，本文从施加内生真菌B3在加速花生残茬秸秆腐解、减少土壤酚酸含量的角度，进一步探索其缓解花生连作障碍的机理。

1 材料与方法

1.1 供试材料

香草酸(Vanillic acid, VA)和香豆酸(p-Coumaric acid,p-CA)均购自Sigma公司，乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。

供试土壤：盆栽土壤取自江西省鹰潭市中国科学院红壤生态实验站，为红黏土发育的红壤(5—20 cm)，多年连作花生。土壤基本理化性质：有机质18.43 g/kg，全氮0.83 g/kg，全磷0.62 g/kg，全钾9.24 g/kg，碱解氮2.45 mg/kg，速效磷19.46 mg/kg，速效钾243.52 mg/kg，pH值 5.6(1∶2.5 H2O)。

花生(Archishypogaea)：为江西省鹰潭市常规品种赣花5号。

花生残体：2011年9月收获赣花5号花生秸秆并晒干，将花生秸秆(粗蛋白13.2%，粗脂肪3.3%，粗纤维32.5%)剪成1 cm大小用于盆栽试验。

内生真菌B3：为拟茎点霉属(Phomopsisliquidambari)，分离自大戟科重阳木(Bischofiapolycarpa)茎内皮。内生真菌菌种B3从PDA(马铃薯葡萄糖固体培养基)斜面转接至PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基)培养基，28 ℃，180 r/min培养2 d，培养好后一部分用于摇瓶降解试验，另一部分抽滤获得菌丝，蒸馏水洗涤3次，取部分菌丝60 ℃烘干48 h测量干重，剩余部分用于DNA提取和施加到试验土壤中。

1.2 试验设计

1.2.1 盆栽试验设计

盆栽试验地点位于南京师范大学植物园(N 31°14′，E 118°22′)，试验盆钵直径28 cm，高23 cm。盆栽试验土壤自然风干后过2 mm筛 (土壤未作灭菌处理)。2012年5月15日装土，每盆装土6 kg，每盆施加尿素1.5 g、Ca3(PO4)23 g、KCl 2.5 g。盆钵埋入土壤，盆口距离地面2 cm。试验分为两部分：A组用于探讨花生残茬腐解效果及木质素纤维素降解率，共设3个处理：对照(CK)；土壤中添加内生真菌B3(B3+)；土壤中添加灭活内生真菌B3(B3-)。每盆折合菌丝干重2 g，同时用5 cm × 5 cm网格袋(孔径1 mm)装花生秸秆残体5 g，每盆放3袋，置于表层土0—15 cm之间，网格袋之间不重叠。B组用于检测土壤酚酸含量(检测的酚酸为花生连作土壤中含量相对较高的4-羟基苯甲酸、香草酸和香豆酸[21])、降解酶活性、内生真菌B3含量及花生农艺性状，同样设3个处理：对照(CK)；土壤中添加内生真菌B3(B3+)；土壤中添加灭活内生真菌B3(B3-)。每盆折合干菌丝2 g，同时添加15 g花生残体并与深度0—15 cm的表层土壤拌匀。试验所有处理每个时间取样点均设3个重复。随后立即播种花生，每盆两粒，保证日照和水分。

分别在播种前(第0 天)、花生萌发期(第10 天)、苗期(第30 天)、开花期(第60 天)、结荚期(第90 天)和成熟期(第110 天)从A组土壤取出网袋，每盆3袋全部取出、混合作为一个重复，用于检测残茬的残留量及木质素纤维素降解率。用内径2 cm土钻在相同时期从B组取0—15 cm深的混合土样，同时在播种第20天时从B组也取土样用于内生真菌B3含量分析。土壤样品分为两部分：用于测定土壤酚酸含量及降解酶活性的样品4 ℃保藏，用于PCR定量分析的土壤样品冻干后-20 ℃保藏。

1.2.2 酚酸类物质的摇瓶降解

内生真菌B3对4-羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, 4-HBA)的降解先前已经研究，证明了内生真菌B3可以对其高效降解[22]。但是，不同酚酸有着复杂的结构多样性，内生真菌B3是否对土壤多样的酚酸类物质具有广谱高效的降解能力，还需要直接的研究证据，因此本文设计以下试验(选用酚酸同1.2.1)：

取2 mL菌丝悬浮液(1.1)分别接种到2种不同碳源的矿物盐培养基中(2 g/L NaNO3，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KCl，0.5 g/L MgSO4，0.01 g/L FeSO4，pH值 6.0)，碳源分别为50 mg/L香草酸(VA)和50 mg/L香豆酸(p-CA)，28 ℃，180 r/min 培养2 d。一部分菌丝抽滤，60 ℃烘干48 h测干重，另一部分菌丝作为相应酚酸类物质降解的种子液。取2 mL种子液(大约1.1—1.2 mg/L的B3菌丝)，接种到50 mL分别以200 mg/L VA和p-CA作为唯一碳源的矿物盐培养基中，28 ℃ 180 r/min 培养，每24 h收集1次发酵液检测酚酸的残留量，同时过滤获得B3菌丝，蒸馏水洗涤3次后60 ℃烘干48 h测真菌生物量。以不添加内生真菌B3作为对照，所有的试验组每个时间取样点均设3个重复。

1.3 分析方法

1.3.1 花生残茬的残留量及木质素纤维素含量检测

网袋取出后，将网袋中剩余花生残茬置于60 ℃条件下烘干至恒重，称量并计算残茬的残留量。残茬中木质素和纤维素含量分别采用浓硫酸法和浓硫酸水解定糖法检测[23]。

1.3.2 土壤及发酵液中酚酸含量检测

土壤中酚酸类物质浸提方法参照Hartley[24]，土壤浸提液和摇瓶试验收集的发酵液过0.22 μm纤维素薄膜后使用HPLC测定[22]。

1.3.3 土壤降解酶活性检测

漆酶(Laccase)、锰过氧化物酶(Manganese peroxidase, MnP)和木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)活性检测分别取1 g新鲜土样置于50 mL离心管，注入9 mL相应缓冲液(漆酶：磷酸盐缓冲液，pH值 6.0；MnP：乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值4.0；LiP：酒石酸钠缓冲液，pH值3.0)，摇床震荡10 min(28 ℃ 180 r/min)，取出后离心5 min(3500 r/min 4 ℃)，上清液即为粗酶液。

酶活测定体积为6 mL。漆酶检测体系包括缓冲液3.7 mL，10 mmol/L ABTS(2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑璘- 6-磺酸)0.3 mL，粗酶液2 mL。MnP测定体系包括相应缓冲液，0.2 mmol/L MnSO4，0.1 mmol/L H2O2，0.4 mmol/L愈创木酚，2 mL粗酶液。LiP测定体系包括相应缓冲液，20 mmol/L藜芦醇，54 mmol/L H2O2，2 mL粗酶液。所有反应均在28 ℃水浴锅中反应3 min，随后立即转入冰水中终止反应。紫外分光光度计测定420 nm、465 nm和310 nm处吸光值的变化来分别反应漆酶、MnP和LiP活性。定义1 min氧化1 μmol ABTS所需的酶量为1个漆酶活力，1 min氧化1 μmol 愈创木酚所需的酶量为1个MnP活力, 1min氧化藜芦醇产生1 μmol藜芦醛所需的酶量为1个LiP活力，单位为U/g干土。每个样品3个重复，以煮沸灭活粗酶液为对照[25- 26]。

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性检测取1 g新鲜土样，置于50 mL三角瓶中，注入10 mL 1%邻苯三酚溶液，震荡(30 ℃ 180 r/min)2 h。取出后加4 mL pH值 4.5柠檬酸-磷酸缓冲液，再加入35 mL乙醚，用力摇荡数次，萃取30 min。最后，将含溶解的紫色没食子素的乙醚相进行比色，比色波长为430 nm。PPO活性以2 h后1 g土壤中紫色没食子素的毫克数来表示。每个样品3个重复，以石英砂作为对照[27]。

1.3.4 DNA提取和实时定量PCR

为了探究内生内生真菌B3在土壤中的存活状况及花生不同生长时期土壤中含量的变化趋势，设计如下试验：

内生真菌B3 DNA提取方法参照Shishido[28]，提取的内生真菌B3基因组DNA稀释10倍以减少PCR扩增的抑制物。使用UltraCleanTMSoil DNA Isolation Kit(Mo BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)提取土壤总DNA。使用特异性引物Bf1(5′-CTG GCC CCC TCG GGG TCC CTG G- 3′)和Br1(5′-TTT CAG GGC CTG CCC TTT TAC AGG C- 3′)扩增B3菌的一段ITS序列(转录间隔区；B3菌株ITS序列号HQ285146)[22]，扩增片段为长度为320 bp。实时定量PCR扩增使用定量PCR仪(ABI step one, USA)，标准曲线制作及扩增反应体系参照文献[29]。

1.3.5 花生农艺指标检测

花生收获时，测定花生株高、主根长、分支数、荚果产量(干重)、秸秆质量(干重)和根瘤数，荚果产量为每盆花生荚果的总质量，根瘤数为每盆花生的总根瘤数。

1.4 数据处理

使用Excel2003进行数据统计和作图。采用SPSS13.0软件进行方差分析(One-Way ANOVA)分别检验不同处理和不同时间段之间的差异显著性，并用Duncan法进行多重比较。

2 结果

2.1 施加内生真菌B3对花生残茬腐解的影响

表1可知，整个取样时期CK和B3-处理在残茬残留量、纤维素木质素降解率之间无显著差异。CK、B3-和B3+处理残茬腐解的变化趋势相似，残茬分解主要都集中在萌发期和苗期，而从开花期至成熟期，残茬腐解率增加速度都较为缓慢。但是，B3+处理在萌发期和苗期就表现出显著加速残茬分解的作用，比CK分别提高了12.0%和14.7%；成熟期残茬腐解率达到84.5%，比CK提高了19.8%。同时，B3+处理花生残茬纤维素和木质素的降解率也显著大于CK，在萌发期纤维素和木质素降解率分别为43.1%和30.4%，比CK提高了13.7%和21.2%；在苗期比CK分别提高了17.8%和26.0%；成熟期花生残茬纤维素和木质素降解率分别为85.2%和71.6%，比CK提高了11.4%和13.8%。上述结果说明施加内生真菌B3可以在较短的时间内加快土壤中花生残茬腐解。

表1 土壤中施加Phomopsis liquidambari (B3) 对花生残茬腐解的影响

2.2 施加内生真菌B3对土壤酚酸含量的影响

表2可知，花生整个生育期B3-处理土壤中4-羟基苯甲酸(4-HBA)、香草酸(VA)和香豆酸(p-CA)含量变化与CK间无显著差异。从萌发期到结荚期，CK和B3+处理土壤中4-HBA含量在各生育期之间发生显著变化，CK中4-HBA的释放量随时间延长而增加并在结荚期达到最大值，比播种前增加了44.9%。B3+处理4-HBA含量则在苗期达到最大值(比CK同期增加46.4%)，随后逐渐下降，结荚期时含量与播种前基本相似。CK和B3+处理不同生育期土壤中VA和p-CA含量也发生显著变化，主要区别为从播种前至结荚期，CK土壤中VA和p-CA含量随着生育期延长而显著增加并在结荚期达到最大值，成熟期时VA和p-CA含量与结荚期相比显著降低，但仍比播种前分别增加了32.0%和34.7%。B3+处理土壤中VA和p-CA含量从萌发期开始逐渐增加，并都在苗期都达到最大值，随后都显著下降，且成熟期与播种前相比VA和p-CA含量分别下降了14.7%和13.5%。总体看来花生不同生育期土壤中酚酸含量随着花生残茬腐解程度差异而不同；在相同生育期，土壤酚酸含量则显著受到接种内生真菌B3的影响，且与CK相比，苗期之前B3+处理显著加快残体中酚酸类物质的释放，开花期及之后，B3+处理土壤酚酸含量显著降低。

表2 施加Phomopsis liquidambari (B3) 对土壤酚酸含量的影响

2.3 施加内生真菌B3对土壤中降解酶活性的影响

表3可知，3种酶活性变化趋势在CK和B3-处理之间无显著性差异。在花生不同生长阶段，CK和B3+处理土壤漆酶、锰过氧化物酶(MnP)和木质素过氧化物酶(LiP)活性均发生显著改变，表明相同处理下不同生育期土壤酶活性大小不同。从播种前到结荚期，CK中土壤漆酶和LiP活性随着花生生育期缓慢增加并达到最大值，与CK相比，B3+处理则增加较快并在苗期达到最大值，而CK和B3+处理土壤MnP活性的最大值均在开花期。除此之外，B3+处理土壤漆酶、MnP和LiP的活性均显著高于同期的CK，说明内生真菌B3的施加可以显著增加土壤中残茬降解酶系的活性，尤其是在苗期和开花期，在花生生长后期与CK相比B3+处理仍然保持相对较高的土壤酶活性。

表3可知，CK和B3-处理土壤PPO的活性大小及变化趋势基本相似。在CK和B3+处理中，从萌发期至成熟期，花生不同生育阶段土壤PPO活性大小显著不同，主要趋势为土壤PPO活性逐渐增加并在结荚期达到最大值(比CK同期提高了47.2%)，随后开始下降，同时可以看出各生长阶段B3+处理PPO活性均显著大于CK，以及在花生成熟时B3+处理的PPO活性仍然相对较高，由此说明随着花生生长土壤中内生真菌B3的施加有益于土壤PPO活性的增加。

表3 施加Phomopsis liquidambari (B3) 对土壤中漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和多酚氧化酶活性的影响

2.4 土壤中内生真菌B3含量的检测

从CK、B3-和B3+ 3个处理土壤中分别提取土壤总DNA进行RT-PCR。在取样的所有时间点内，CK和B3-处理都没有检测到内生真菌B3的存在，而在B3+处理，接种前并没有检测到内生真菌B3的基因组DNA，接种后检测到B3的基因组DNA，并在第10 天时达到最高值5.43 log(pg DNA/g 干土)，随后土壤内生真菌B3的基因组含量逐渐下降，在第30天时下降到0.21 log(pg DNA/g 干土)，而在第60天的土壤样品中未能检测到内生真菌B3的基因组DNA的存在(图1)。

2.5 纯培养条件下内生真菌B3对酚酸类物质的降解

表4显示分别接种96 h和120 h后内生真菌B3对香草酸(VA)和香豆酸(p-CA)的降解率都达到99%以上，真菌生物量分别从1.2 mg/L和1.1 mg/L增加到556.7 mg/L和450.0 mg/L，同时未添加内生真菌B3的CK中VA和p-CA的浓度没有显著性改变。可以看出内生真菌B3对VA和p-CA的大量降解以及自身生物量的增加主要集中在24—72 h，0—24 h可能是内生真菌B3对新环境的调节适应阶段，而72—96 h则主要集中于对VA和p-CA降解产物的进一步降解。由此说明内生真菌B3对花生连作土壤中多种酚酸类化感物质具有广谱高效的降解能力。

图1 B3+处理组土壤中Phomopsis liquidambari (B3) DNA含量

表4 Phomopsis liquidambari (B3) 对VA和p-CA的摇瓶降解

2.6 施加内生真菌B3对花生农艺性状的影响

表5可知，CK和B3-处理花生农艺性状之间的差异并不显著。与CK相比，B3+处理花生主根长、荚果产量、秸秆干重以及根瘤数都有显著的增加，其中荚果产量、秸秆干重和根瘤数分别增加了19. 9%、16.1%和21.9%。

表5 高花生残茬土壤中施加Phomopsis liquidambari (B3) 对花生农艺性状的影响

3 讨论

3.1 高花生残茬土壤中施加内生真菌B3改善花生农艺性状的机理

Berg和McClaugherty把凋落物分解划为早期阶段、后期阶段和限值阶段[30]。自然环境中，作物残茬腐解速率的快慢受多种因素制约，包括残体自身的物理化学性质、气候条件以及土壤微生物群落结构等[31]，其中残茬本身木质素的含量是影响其分解速率和降解过程的重要因素，因为土壤中含有大量降解纤维素菌群，而降解木质素的微生物群体却相对较少[18,32]。实验表明在苗期之前B3+处理土壤中内生真菌B3含量较高并显著促进花生残茬腐解，残茬腐解直接为土壤提供可溶性碳氮和其它营养元素，促进花生生长的同时也为土壤微生物的繁殖提供了丰富的营养。因此，内生真菌B3的施加可能优化了土壤微生物区系，残茬腐解过程中具有降解酶分泌能力的微生物群体大量增加，所以，即使苗期之后土壤内生真菌B3含量下降，但这种优化作用基本已经完成并有助于土壤中对花生残茬腐解起关键作用的漆酶、MnP和LiP活性的提高。作物生长后期土壤中内生真菌B3已经死亡以及先前添加的作物残茬基本降解完全，土壤养分降低，使得具有降解酶分泌能力的微生物数量下降，酶活性降低，但是在花生成熟期土壤中降解酶活性与播种前相比仍然较高，主要原因可能是植株生长后期地上部分已开始衰老、枯死，植株本身的凋落物以及微生物菌群进入土壤，这些凋落物是后期多种微生物生长的能量来源，所以植株生长后期其土壤中降解酶的活性仍然相对较高。在苗期处理组，花生残茬腐解产生的酚酸量达到最大值，显著高于同期的CK，主要归因于内生真菌B3自身对花生残茬的降解能力及其对土壤微生物区系的调节功能。通常情况下，酚酸类物质作为化感物质当其含量超过阈值范围时会显著影响土壤微生态活性[33- 34]，进而对作物的生长产生较强的抑制作用[34]，然而本研究发现内生真菌B3的施加促进了花生残茬的快速腐解，相应的土壤中对酚酸具有降解作用的酶类以及转化酚类物质的PPO活性都显著的增加，这些酶活性的增加对土壤中酚酸类自毒物质的降解及转化具有重要的作用[35- 36]，同时在花生收获时发现B3+处理花生荚果产量及根瘤数均比CK有显著增加。已有报道土壤酚酸类物质的浓度在一定范围内对植物生长具有调节作用[37]，土壤中短暂高浓度的酚酸类物质对幼苗的生长影响较小[19]，但是，从开花期至成熟期，CK土壤酚酸的含量逐渐增多，此时持续高浓度的酚酸类物质可能表现出较强的化感抑制作用因而被认为是花生产生连作障碍的主要原因之一[38]。然而在B3+处理，开花期和结荚期土壤酚酸含量与CK相比显著降低，从而减少了化感物质的负面作用。花生开花期至结荚期根系开始被根瘤菌侵染逐渐形成根瘤，这一时期酚酸类化感物质的减少具有重要的意义[39]。因此，高花生残茬土壤中施加内生真菌B3可以有效缓解残茬腐解对花生生长的负面影响，主要通过减少酚酸的浓度、促进营养循环、调节土壤微生态环境从而改善花生的农艺指标，达到减轻花生连作障碍的目的。

3.2 内生真菌B3短暂的腐生生活和潜在的生态调节功能

Osono和Promputtha指出不可能所有的内生真菌都能发展成为腐生生物，但是内生真菌在特殊的条件下可以转换它们的生态角色并适应腐生生活，其在真菌分解者中比例大约为0—92%[40- 41]。自然条件下内生真菌B3离开宿主后可以进行营腐生生存，并且在农业生态系统中具有较强的环境修复能力，主要包括改善土壤微生物群落结构、提高土壤酶活性、增加微生物量CN、减少病原菌数量及增加作物抗性和产量等[20,42- 44]。本研究表明高花生残茬土壤中施加内生真菌B3可以显著加快残茬腐解并促进酚酸类物质释放，调节残茬降解及酚酸转化相关酶系，同时摇瓶降解表明内生真菌B3对连作土壤多种酚酸类物质具有较强的降解效率。即使在复杂的土壤环境中，内生真菌B3一方面自身可以降解酚酸类化感物质，另一方面也可以改善土壤微生物区系进一步有利于多种微生物联合对自毒物质的降解，缓解作物连作障碍的发生。由于农业生态系统的高度复杂性，现阶段关于内生真菌B3如何缓解作物连作障碍的机制还不完全清楚。推测可能原因如下：(1)内生真菌B3减轻了化感物质对植物生长的影响；(2)内生真菌B3的添加有利于农业生态系统中微生物群落多样性的恢复，改善土壤微生态环境，提供适合作物生长的土壤微生态体系；(3)内生真菌B3在体外分泌一些营养物质促进作物生长[45]。

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Effects of an endophytic fungus on decay of peanut residues and phenolic acid concentrations in soil

XIE Xingguang1, DAI Chuanchao1, SU Chunlun1, ZHOU Jiayu1, WANG Hongwei1, WANG Xingxiang2,3,*

1JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomics,JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforIndustrializationofMicrobialResources,CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing210023,China2KeyLaboratoryofSoilEnvironmentandPollutionRemediation,InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China3JiangxiKeyLaboratoryofEcologicalResearchofRedSoil,EcologicalExperimentalStationofRedSoil,ChineseAcademyofSciences,Yingtan335211,China

Peanut residue in the soil is considered to be an obstacle to peanut replanting. We aimed to understand the effect of applying an endophytic fungus [Phomopsisliquidambari(B3)]on accelerating peanut residue decay, improving the micro-ecological environment in the soil, and alleviating an obstacle to peanut replanting as well as its possible mechanism. We investigated the dynamics of peanut residue decay, phenolic acid concentrations, and enzyme activities during peanut growth in a pot experiment, where peanut residues were added into soil. Results showed that applying endophytic fungus B3 (treatment B3+) significantly accelerated the decay of peanut residue at the peanut germination and seedling stages; the decay rate increased by 12.0%—14.7% and the degradation rate of cellulose and lignin increased by 13.7%—17.8% and 21.2%—26.0%, respectively, compared with controls (CK). From the flowering to maturation stages, the decay rate of peanut residues gradually decreased in treatment B3+, but remained higher than that in CK. In addition, the concentrations ofp-hydroxybenzoic acid (4-HBA), vanillic acid (VA), andp-coumaric acid (p-CA) in treatment B3+ were significantly greater than those in CK at the germination and seedling stages. This indicated that application of endophytic fungus B3 significantly promoted the release of phenolic acids during decay of peanut residues before the seedling stage.The concentrations of the three kinds of phenolic acids in CK were much greater than those in treatment B3+ from flowering to maturation stages, which were critical stages for peanut formation and disease control; a high concentration of phenolic acids was harmful to peanut growth. In treatment B3+, the activities of laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase, and polyphenol oxidase were all significantly greater than those in CK at the corresponding peanut growth period, and peanut pod yield increased by 19.9%, compared with CK. Increases in activities of soil enzymes, which were associated with decay of peanut residues in treatment B3+, should be beneficial to decay of peanut residues and accelerate conversion of harmful phenolic acid allelochemicals. However, there was no significant difference in the decay rate of peanut residues, phenolic acids concentrations, enzyme activities, and peanut pod yield between treatment B3 (applying sterilized endophytic fungus B3) and CK, indicating that the availability of the endophytic fungus B3 in soils is important. To further demonstrate the availability of B3 and its role in degradation of phenolic acids, a real-time quantitative polymerase chain reaction technique was used to monitor dynamics of endophytic fungus B3 during peanut growth. The biodegradability of B3 was also investigated in pure culture. The results showed that endophytic fungus B3 could adapt to a non-host environment and survive for about 30 d in soil containing higher amounts of peanut residues under natural conditions after detaching from its host. With 200 mg/L VA andp-CA as the sole carbon source, the degradation rate of VA for 96 h andp-CA for 120 h reached 99% after inoculation with B3, and the biomass of B3 increased gradually with time after inoculation. The results suggested that promoting the rapid degradation of peanut residues and regulating dynamics of phenolic acids should be important mechanisms for B3 to alleviate obstacles in peanut replanting.

peanut residues; continuous cropping obstacles; phenolic acids; endophytic fungus; soil enzyme activity

国家科技支撑计划资助项目(2012BAD05B04); 国家自然科学基金资助项目(31370507, 30970523); 江苏省高校自然科学研究重大项目(13KJA180003); 南京市科委工程中心创新能力提升项目(201105058)

2013- 08- 13;

2014- 06- 12

10.5846/stxb201308132074

*通讯作者Corresponding author.E-mail: xxwang@issas.ac.cn

谢星光, 戴传超, 苏春沦, 周佳宇, 王宏伟, 王兴祥.内生真菌对花生残茬腐解及土壤酚酸含量的影响.生态学报,2015,35(11):3536- 3845.

Xie X G, Dai C C, Su C L, Zhou J Y, Wang H W, Wang X X.Effects of an endophytic fungus on decay of peanut residues and phenolic acid concentrations in soil.Acta Ecologica Sinica,2015,35(11):3536- 3845.