VEGF和PEDF在不同病程糖尿病大鼠视网膜病理改变中表达的意义

李儒华，余锦强

(湖北医药学院附属人民医院,湖北 十堰 442000)

VEGF和PEDF在不同病程糖尿病大鼠视网膜病理改变中表达的意义

李儒华，余锦强

(湖北医药学院附属人民医院,湖北 十堰 442000)

目的 探讨血管上皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)在不同病程糖尿病大鼠视网膜中的表达情况。方法 将雄性SD大鼠120只按照随机数字表格法划分为正常对照组与糖尿病组，每组60只。将糖尿病大鼠按照一次性腹腔注射链脲佐菌素方法制作成糖尿病模型。成模后1，3，5个月 分别应用透射电镜切片、视网膜EB含量测定法观测大鼠视网膜的病理变化情况，同时应用Western-blot 技术以及免疫组化染色测定糖尿病大鼠视网膜中VEGF、PEDF表达情况。结果 EB染色显示正常对照组大鼠的视网膜血管形态较好；1个月时糖尿病大鼠视网膜血管较规则；3个月时糖尿病大鼠视网膜血管迂曲，有部分改变；成膜后5个月时糖尿病大鼠视网膜血管迂曲已经十分明显，且走行不规则，血管粗细不均。同时成模后1，3，5个月糖尿病组大鼠EB含量均高于正常对照组(P均<0.05)，且随病程进展，其含量也增加。免疫组化显示糖尿病大鼠VEGF的阳性染色会随病程进展而有所增强，光密度值增大；PEDF阳性染色则随病情进展而减弱，同时光密度值减小；与正常对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。Western-blot法检测显示随着病情进展，糖尿病组各阶段大鼠的视网膜VEGF蛋白含量随之增加，而PEDF蛋白则减少，与正常对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 最早可观察到的视网膜病变是视网膜细胞超微结构病理变化，会随病情进展加重；视网膜血管形态在病情中后期会发生变化，且随病情加重而加重；在初期，视网膜的VEGF与PEDF表达已经失衡，且随病情进展，VEGF表达增加，PEDF表达减少，二者失衡贯穿于整个病情的发展过程中。

糖尿病性视网膜病变；血管上皮生长因子；色素上皮衍生因子

目前，对于糖尿病视网膜病(DR)的治疗以及早期干预还没有较好的途径和方案，而其危害性又不容忽视，其发病机制以及防治措施已经成为当前研究的重点。目前研究证实，DR发病机制复杂，是多种途径共同作用的结果，其与细胞因子、氧化应激反应、蛋白激酶C的激活以及糖基化终末产物堆积、多元醇通路出现异常均有关[1]。在诸多因素中，细胞因子对于DR病程的进展起到了重要的作用，在正常状态下，机体所表达的细胞因子处于动态平衡，在病理状态下平衡被打破，细胞因子失衡，进而引发视网膜结构及功能变化[2-3]。因此研究这些与DR有关的细胞因子就显得尤为重要，这些因子在整个发病过程及发病机制中的作用都关系到对病情的控制。色素上皮衍生因子(PEDF)与血管内皮生长因子(VEGF)被认为是新生血管抑制因子系统与血管刺激因子系统的典型代表，二者的平衡对视网膜的功能及结构有重要意义[4-5]。但目前对这2种因子的研究尚缺乏理论支持，当前最为广泛的研究也多集中在增生性DR中，对临床前期以及非增生性视网膜病变的研究尚少[6]。本研究观察了VEGF与PEDF在DR大鼠视网膜中的表达情况，分析了二者在DR发生发展中的作用，旨在为临床提供理论依据。

1 实验资料

1.1 主要仪器与试剂 伯乐公司Bio-Rad680酶标仪；尼康公司荧光显微镜；美国 Sigma 公司高速冷冻离心机；强生公司血糖试纸；白云山制药公司尿糖试纸以及PVDF转移膜等。美国Sigma 公司的链脲佐菌素；北京中杉金桥公司的免疫组化试剂盒以及兔抗鼠VEGF抗体；英国abcam公司小鼠抗PEDF及兔抗VEGF单克隆抗体等。

1.2 动物分组及造模 选择健康雄性远交群SD大鼠120只，周龄8～11周，体质量180～200 g，动物合格证号：syxk(鄂)2011-0031。入选大鼠先行1周饲养，自由进食饮水，随后按照随机数字表格法分成正常对照组与糖尿病组，每组60只。糖尿病组大鼠按照一次性腹腔注射链脲质菌素制作糖尿病模型[7]。

1.3 透射电镜观察大鼠视网膜超微结构 成模后1,3,5个月每组各随机选取大鼠2只，麻醉处理后摘取眼球，在显微镜下顺沿角膜边缘剪开眼球，去除玻璃体，将含有视网膜的眼杯放入2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃下固定下4 h，取出眼杯使用磷酸盐缓冲液冲洗，随后经四氧化锇固定2 h，再应用PBS缓冲液冲洗，丙醇与乙醇梯度脱水，再采用环氧树脂进行浸透包埋，最后制成超薄的切片，应用透射电镜观察。

1.4 视网膜EB含量检测 成模后1，3，5个月每组各选取大鼠3只，麻醉处理后，从右颈静脉注入50 mg/kg的EB溶液，经2 h的循环后(为了维持大鼠生命体征可行气管插管)，打开大鼠胸腔暴露其心脏，从左心室灌注多聚甲醛并循环3 min后摘取眼球，于显微镜下小心取出视网膜，过夜晾干后使用电子秤称量其质量。随后与甲酰胺150 μL在70 ℃下孵育18 h。经高速离心处理约1 h，再取其上清液，使用酶标仪测定吸光度值及标准化的EB含量。

1.5 视网膜VEGF、PEDF免疫组织化学染色 成模后1，3，5个月每组各选取大鼠4只，麻醉处理后，于显微镜下去除玻璃体，将含有视网膜的眼杯放入10%福尔马林溶液中固定24 h，取结构完整的视网膜切片，常规脱蜡，滴入枸盐酸缓冲液，使用PBS洗涤处理，在室温下孵育10 min，室温下封闭处理15 min，再滴加兔抗鼠抗体，4 ℃下过夜。脱水处理后封片，随后使用图像处理分析软件观察染色区的光密度值。

1.6 Western-blot法检测视网膜 VEGF、PEDF 含量 成模后1，3，5个月每组各随机选样大鼠4只，麻醉后处死，取其眼球，在显微镜观察下去除玻璃体，小心分离视网膜，于-80 ℃下液氮冷冻保存；提取视网膜总蛋白，将视网膜组织放置于10倍体积的组织裂解液中匀浆，匀浆彻底后将其转移至离心管中离心20 min，取其上清液保存于-20 ℃下。将视网膜蛋白上清液提取后，应用酶标仪测定所选样品的蛋白总含量。

2 结 果

2.1 大鼠视网膜结构 正常对照组大鼠的视网膜细胞基底膜完整，且有连续性，膜盘结构清楚，外核以及内核层的细胞核染色质均匀，神经节细胞胞质丰富，细胞核较大且明显，同时表面可见突起，见图1。成模后1个月，糖尿病组大鼠的视网膜色素上皮细胞胞质出现线粒体空泡，部分膜盘出现模糊，间隙大，外核与内核层细胞排列规则，染色质有轻微密集，细胞胞质较丰富，出现少量线粒体空泡变性，见图2。成模后3个月，糖尿病组大鼠视网膜基底膜有不连续现象，且增厚，内皮细胞有增生，间隙大，出现空泡样，部分已经溶解且断裂，外核层细胞核染色质及细胞排列均不规则，神经节细胞线粒体肿胀同时有空泡样改变，见图3。成模后5个月，糖尿病组大鼠视网膜基底膜连续性较差，内皮细胞突起，吞饮泡明显增多，膜盘大量溶解或者断裂，外核与内核层细胞排列紊乱，神经节细胞胞浆内出现大量空泡，有线粒体肿胀，细胞核核膜消失或者表现核固缩，见图4。

2.2 大鼠视网膜血管形态 正常对照组大鼠视网膜血管管径粗细均匀，走行较规则，无荧光渗漏，见图5；成模后1个月糖尿病组大鼠视网膜血管血管管径粗细均匀，走行也相对规则，无明显荧光渗漏，见图6；成模后3个月糖尿病组大鼠视网膜血管管径粗细不均，走行迂曲，有少量荧光渗漏，见图7；成模后5个月糖尿病组大鼠视网膜血管已经出现病理改变，血管迂曲十分明显，走行紊乱，管径粗细不均，大量的荧光渗漏，见图8。

图1 正常对照组大鼠视网膜结构

图2 成模后1个月糖尿组组大鼠视网膜结构

图3 成模后3个月糖尿病组大鼠视网膜结构

图4 成模后5个月糖尿病组大鼠视网膜结构

2.3 不同病程阶段糖尿病大鼠视网膜EB含量 伴随病程的进展，糖尿病大鼠视网膜EB含量均有所增加(P均<0.05),且均高于正常对照组(P均<0.05)。见表1。

图5 正常对照组大鼠视网膜血管形态

图6 成模后1个月糖尿病组大鼠视网膜血管

图7 成模后3个月糖尿病组大鼠视网膜血管形态

图8 成模后5个月糖尿病组大鼠视网膜血管形态

表1 不同病程阶段大鼠视网膜EB含量

注：①与正常对照组比较，P<0.05;②与1个月时比较，P<0.05;③与3个月时比较，P<0.05。

2.4 大鼠视网膜VEGF、PEDF表达情况 视网膜中的VEGF、PEDF阳性表达为黄褐色。正常对照组中VEGF主要分布在神经节的细胞层面，在内核当中也有一定量的表达，表现为弱阳性。糖尿病组伴随病程延长，VEGF阳性表达出现明显增强现象，成模1个月后，VEGF在内丛状层、内核层以及视网膜神经节细胞层均有一定表达；成模3个月后，VEGF在外核层有一定量的表达，成模5个月后，几乎在视网膜的各个层面均有VEGF表达。正常对照组中PEDF呈强阳性反应，在视网膜的各层面都有表达。糖尿病组成模1个月后，PEDF在大鼠视网膜的内丛状层、内核以及外核层、神经节细胞层等均有表达；成模3个月后，PEDF在内丛状层、神经节细胞层及内核层中有表达；成模5个月后，PEDF仅在视网膜的内丛状层及神经节细胞层面有所表达。伴随病程的进展，糖尿病大鼠视网膜中VEGF 蛋白表达量明显增加(P均<0.05)，PEDF 蛋白表达量显著减少(P均<0.05),与正常对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 不同病程阶段大鼠视网膜VEGF、PEDF蛋白表达光密度值比较

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与1个月时比较，P<0.05；③与3个月时比较，P<0.05。

3 讨 论

DR视网膜病变的主要病理变化包括视网膜功能及形态学的改变。过去一直认为DR的早期病变主要表现为糖尿病中后期的视网膜微血管病变，但近年来的研究表明，早期的糖尿病阶段，视网膜就已经出现了病理性改变，感光细胞出现水肿及退行性变；在整个病程的发展早期，神经节细胞核膜已经消失，同时细胞胞体也已经变形，可见光感受器细胞数目有所减少，内皮细胞肿胀[8]。本实验结果显示，糖尿病发生1个月时，大鼠的视网膜膜盘、色素上皮细胞、内核以及外核层细胞以及神经节细胞结构都出现了病理变化，且伴随病程进展，糖尿病大鼠视网膜细胞的超微结构病理变化也随之加重，发展至5个月时，视网膜细胞超微结构的病理变化已经十分严重。

目前研究视网膜病的发病机制，从而来防治糖尿病视网膜病已经成为当前的热点和主题。研究发现造成糖尿病视网膜病的主要因素是视网膜微血管系统病变，而对于可否维持视网膜正常功能及结构，维持新生血管形成及视网膜血管通透性，VEGF 与 PEDF 的平衡状态则起到了重要作用[9]。VEGF会造成血管内皮细胞的迁移与增殖，PEDF会对这一过程产生抑制，提示PEDF下降为DR发病的重要因素。PEDF因子属于内源性抗炎因子，在DR中，其表达水平的降低也是导致血管渗漏以及炎症产生的主要因素，PEDF会对MCP-1等炎性因子产生抑制，这说明PEDF是通过抑制炎性因子而起到保护DR的作用[10]。另外，PEDF因子具有较强的抗氧化性，能够与谷胱甘肽过氧化物酶作用并抑制其所诱发的细胞损害，从而与过氧化物对抗，防止其诱发细胞凋亡以及细胞功能障碍；同时PEDF因子可以增加细胞胞质的紧密粘连蛋白的进一步表达[11]。本研究发现，糖尿病大鼠视网膜细胞中的VEGF 与 PEDF表达严重失调，表现为VEGF增加而PEDF明显减少。且在糖尿病初期，VEGF、PEDF 表达失衡就已经存在，并且会随着病程的进展而表现为VEGF表达逐渐增多，而PEDF 表达逐渐降低，二者的这种失衡状态存在于整个病变的发生发展过程中，提示对二者进行有效调节使其达到平衡状态是治疗DR的关键，这为该病临床治疗方案的制订奠定了基础。

[1] 张改丽，徐四俊，肖云，等. 玻璃体腔注射鼠神经生长因子对糖尿病视网膜大鼠视网膜结构的影响[J]. 眼科新进展，2011，31(10):917-921

[2] 邱梅园，彭燕一，黄岚珍，等. 向秋.PDGF-α受体反义寡核苷酸对体外视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡的影响[J]. 国际眼科杂志，2011，11(2):229-231

[3] 吴晋晖，高玉，柳林. 不同病程糖尿病大鼠视网膜VEGF和PEDF 表达的动态变化[J]. 眼科新进展，2010，30(9):809-814

[4] 李琳. VEGF和PEDF在糖尿病脉络膜视网膜病变中的实验研究[D]. 重庆：重庆医科大学，2006

[5] 刘彦. 糖尿病视网膜病变眼内液中PEDF、VEGF的定量分析[D]. 天津：天津医科大学，2006

[6] 苏钰，陈长征. VEGF 可溶性受体sflt-1 在脉络膜视网膜疾病中的研究进展[J]. 国际眼科纵览，2010，34(4):247-250

[7] 高玉，吴晋晖.链脲佐菌素诱发性糖尿病大鼠早期视网膜病变模型的建立[J]. 第二军医大学学报，2010,31(10)：1053-1059

[8] 李小璐，马雅玲. 不同病程糖尿病大鼠视网膜病变的研究[J]. 宁夏医科大学学报，2013,35(8)：890-893

[9] 徐庆胡，袁源智，王历阳，等. AMD3100 对小鼠高氧诱导视网膜病变中新生血管的抑制作用[J]. 中华眼科杂志，2012，48(4):350-355

[10] Cao R,Ji H,Feng H,et al. Collaborative interplay between FGF-2 and VEGF-C promotes lymphangiogenesis and metastasis[J]. Proc Nati Acad Sci USA,2012,109(39):15894-15899

[11] Mima A,Qi W,Hiraoka-Yamomoto J,et al. Retinal not systemic oxidative and inflammatory stress correlated with VEGF expression in rodent models of insulin resistanceand diabetes[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(13):8424-8432

Significance of VEGF, PEDF expression in retinal pathological changes of different course of diabetic rats

LI Ruhua, YU Jinqiang

(The People’s Hospital Affiliated to Hubei Medical University, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to observe the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and pigment epithelium-derived factor (PEDF) in the retina of different course of diabetic rats.Methods 120 cases of male outbred rats (SD rats) were selected to divide into the normal control group and diabetes group according to the random number table method as 60 cases in each. The diabetic rat model was made by intraperitoneal injection of streptozotocin method. After 1, 3, and 5 month, the retinal pathological changes were observed by transmission electron microscope and retinal EB content determination method respectively, and the expression of VEGF and PEDF in the retina of diabetic rats were observed by Western-blot technology and immunohistochemical methods. Results The EB staining showed of the retinal vessels morphology in rats of normal control group was good, the retinal vessels was regular in the first month, and they was tortuose with some changes in the third month; After modeling success in the fifth month, the tortuosity had been very clear, and go for irregular with uneven thickness of vascular. At the same time, the EB content in rats of diabetic group in the 1st, 2nd, and 3rd month after modeling successful were significantly higher than that of normal control group (allP<0.05), and content was increased with the progress of the disease. Immunohistochemistry showed, the positive staining of VEGF in diabetic rats was increased with disease progression, the value of optical density was increased; the positive staining of PEDF was increased with the progress of the disease and weakened, and the value of optical density was decreased. There were significant differences between the control group and diabetic group (allP<0.05). Western-blot assay showed that the retinal VEGF protein content in each stage of diabetic group were increased with the progress of the disease, and the PEDF protein were decreased, there was significant difference between control group and diabetic group (P<0.05). The structure of retinal cells in DM1 group rats had changed, and these changes will be aggravated with the progression of course of disease. Conclusion The earliest observable retinopathy is retinal cell ultrastructure pathological changes, will increase with the progress of the disease; retinal vascular morphology of late in the illness will change, and increased with the severity of illness; In the early days, VEGF and PEDF in retinal expression has imbalance, and with the progress of the disease, the expression of VEGF is increased, PEDF expression is decreased, the imbalance of them is throughout the development process of disease.

diabetic retinopathy; vascular endothelial growth factor; pigment epithelium derived factor

李儒华，男，主治医师，主要从事角膜病、白内障、眼底病等研究。

余锦强，E-mail:yujinqiang365@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.009

R-332

A

1008-8849(2015)21-2307-04

2015-01-15