脑缺血预处理对大鼠外周血内皮祖细胞及血管新生的影响☆

张旭东王也刘然王娜毕国荣

·论 著·

脑缺血预处理对大鼠外周血内皮祖细胞及血管新生的影响☆

张旭东*王也*刘然*王娜*毕国荣*

目的探讨脑缺血预处理对缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）大鼠外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）及缺血区脑组织血管新生的影响，并分析EPCs的数量与血管新生关系。方法SD大鼠108只，随机分为3组：假手术（sham operation，SO）组、大脑中动脉缺血(middle artery occlusion, MCAO)组、脑缺血预处理(brain ischemic preconditioning,BIP)组，各36只，每组再分为缺血再灌注前0 h、缺血再灌注后3 h、24 h、3 d、5 d、7 d 6个时点，每个时点6只大鼠。用Zea Longa评分标准进行神经功能评分。用流式细胞仪计数外周血EPCs数目。用免疫组织化学染色法检测缺血区脑组织新生血管密度。结果①神经功能缺失评分:再灌注3 h后，BIP组、MCAO组均出现不同程度的神经功能缺失，且BIP组较MCAO组评分低（5 d:1.00± 0.63;7 d:1.00±0.63,P＜0.05）；②外周血EPCs数目:再灌注3 h后，MCAO组外周血EPCs数目开始降低，BIP组逐渐升高，且BIP组较MCAO组明显增加（24 h:0.58±0.07;3 d:0.80±0.10;5 d:0.68±0.05;7 d:0.52±0.03,P＜0.01）；③新生血管数目：BIP组、MCAO组分别于再灌注后3 d、5 d出现新生血管，且BIP组较MCAO组多（5 d:14.53± 3.44;7 d:41.40±5.62,P＜0.01）；④Pearson相关分析表明，缺血区脑组织新生血管密度与外周血EPCs数量呈正相关(5 d:r=0.855,P＜0.01;7 d:r=0.946,P＜0.01)。结论BIP能促进脑IRI大鼠EPCs的动员，有助于增加缺血区脑组织血管新生。

缺血预处理 缺血再灌注损伤 内皮祖细胞 新生血管化

内皮祖细胞是内皮的前体细胞，主要来源于骨髓，具有分化、成熟及参与新血管形成的能力。生理状态下外周血中的EPCs数量很少,在缺血、损伤等病理状态下可动员骨髓中的EPCs到外周血，参与血管新生，修复损伤内皮。近年发现EPCs在脑缺血性损伤中发挥重要作用[1-2]。脑梗死后,EPCs参与梗死区新血管的形成[1]，后者在维持神经系统稳态、修复损伤、促进神经再生方面发挥重要作用[3-4]。BIP是重要的内源性保护机制[5-6]。现有的研究多关注肾脏、心脏缺血预处理后EPCs及血管新生情况的改变[7-8]，本文意在探讨BIP后外周血EPCs数目的变化及缺血区血管新生情况的改变，进一步研究BIP的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理雄性SD大鼠108只，体重260～310 g。将大鼠随机分为3组：SO组、MCAO组及BIP组，各36只。每组再分为MCAO前0 h、MCAO后3 h、24 h、3 d、5 d、7 d 6个时点，每个时点6只大鼠。分别作如下处理：SO组：以假手术代替预缺血及缺血再灌注；MCAO组：以假手术代替预缺血，其余步骤同BIP组；BIP组：MCAO 20 min后抽出线栓，完成预缺血，3 d后再次行MCAO 2 h。

1.2 动物模型与标本制备参照改良Longa线栓法进行MCAO造模。采用大脑中动脉二次线栓法[9]制备大鼠BIP模型：结扎左侧颈外动脉远端，在结扎线近端距分叉5 mm处剪口，将线栓从颈外动脉残端插入至颈总动脉分叉部以上18～20 mm，20 min后抽出线栓，完成预缺血，3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后按规定时间点取血取脑。待大鼠清醒后，对其进行神经功能评分：无神经功能受损体征为0分；不能完全伸展对侧前爪为1分；行走时向对侧转圈为2分；向对侧倾倒为3分；不能自发行走，意识丧失为4分，达1～3分为MCAO再灌注模型成功。

1.3 外周血EPCs检测①按规定时间点取眶静脉血,采用密度梯度离心法，利用大鼠单核细胞分离液（Sigma公司）收集单核细胞。②以CD34（Santa Cruz公司）、CD133（博奥森公司）为一抗，以异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate,FITC）、藻红蛋白（Phycoerythrin,PE）为二抗制成单个核细胞悬液。用流式细胞仪（美国BD公司）检测单个核细胞悬液，每份标本检测1万个细胞，以CD34、CD133双阳性细胞占单核细胞的比例表示外周血EPCs数目。

1.4 缺血区脑组织新生血管密度测定取梗死区脑组织进行石蜡包埋、标本以3µm厚度进行切片，行CD31（Abcam公司）免疫组织化学染色测定缺血区脑组织新生血管密度。每张切片在高倍镜（200倍）下随机选取5个视野，用各视野可计数的毛细血管数目平均值表示新生血管密度。棕色封闭的圆形或类圆形为可计数的毛细血管，凡分辨不清或染色模糊的、管腔大于8个红细胞大小的均为不可计数的毛细血管，每张切片由2人计数，结果相差10%以上者重新计数。

1.5 统计学方法采用SPSS17.0进行统计学处理，所有资料采用（±s）表示，组间比较用方差分析进行检验，Pearson相关性分析用于检验外周血EPCs数目与新生血管密度的相关性，检验水准α= 0.05。

2 结果

2.1 BIP对神经功能缺失的影响SO组各时间点及BIP组、MCAO组0 h均未见神经功能缺失。再灌注后3 h、24 h、3 d：BIP组（2.33±0.82、2.00±0.89、1.67±0.52）及MCAO组（2.33±0.52、2.17±0.75、2.00±0.63）均有不同程度的神经功能缺失，但无统计学差异（P＞0.05）；再灌注后5 d、7 d：BIP组（1.00±0.63、1.00±0.63）与MCAO组（1.83±0.41、1.83±0.41）相比，神经功能缺失明显好转（P＜0.05）。

2.2 BIP对外周血EPCs数目的影响SO组各时间点EPCs数目均未发生明显变化（P＞0.05）。在0 h、3 h：MCAO组及BIP组与SO组相比无明显变化（P＞0.05），且MCAO组与BIP组无差异（P＞0.05）。再灌注后24 h、3 d、5 d：MCAO组低于SO组（P＜0.01），再灌注后7 d：MCAO组恢复至SO组水平（P＞0.05）。再灌注后24 h、3 d、5 d、7 d：BIP组均高于SO组（P＜0.01），且BIP组高于MCAO组（P＜0.01）（见表1、图1）。

2.3 BIP对缺血区脑组织血管新生的影响再灌注后3 d，BIP组即可见新生血管，而SO组、MCAO组均于再灌注后5 d才可见。BIP组新生血管数目（5 d:14.53±3.44;7 d:41.40±5.62）较MCAO组（5 d: 9.83±2.56;7 d:24.07±5.06）明显增多(P＜0.01)，且BIP组、MCAO组均较SO组（5 d:2.47±1.85;7 d: 3.47±2.11）增多（P＜0.01）（见图2）。

2.4 外周血EPCs的数量与新生血管密度的关系

Pearson相关性分析显示，在BIP组和MCAO组中，外周血EPCs数目同新生血管密度呈正相关(5 d: r=0.855,P＜0.01;7 d:r=0.946,P＜0.01)。

3 讨论

脑卒中尤其是缺血性卒中已成为人类致死致残的主要原因之一，EPCs在缺血性卒中的发生发展、治疗和预后中的作用备受关注。研究发现给大鼠移植骨髓来源的EPCs能显著减轻脑IRI，其机制可能与细胞凋亡、氧化应激效应及NF-κB的表达减少有关[2]。脑梗死急性期的患者循环EPCs数量显著高于高危对照者，在缺血后48 h，低水平的EPCs数量是严重神经功能缺失的独立预后因素，而EPCs数量的增多是提高恢复期NIHSS评分的独立因素，且急性脑梗死后循环EPCs数量与正常对照者无明显差别[10]。而在本研究中，急性脑缺血再灌注3 h后，外周血EPCs数目明显降低，至7 d才恢复到正常值水平，推测可能与急性脑缺血后早期，大量动员到外周血中的EPCs参与了缺血区脑组织血管的修复与新生，从而被大量消耗，且消耗的程度大于骨髓的动员程度有关[11]。在5 d、7 d时，MCAO组新生血管数目较SO组明显增多，说明缺血能促进损伤脑组织形成新的血管，与之前的研究结果基本一致[12]。

图1 各组大鼠外周血EPCs数目随时间变化趋势

表1 各组大鼠外周血EPCs数目

缺血预处理对各种缺血组织的保护机制已被广泛关注，近期研究很多集中在缺血预处理如何影响EPCs的变化而发挥保护作用[7]。在本研究中，BIP组缺血再灌注后早期即出现外周血EPCs数量增多，3 d时达高峰，此后虽逐渐下降，至7d时仍高于SO组，且BIP组在5 d、7 d时神经功能缺失评分明显低于MCAO组，因而推测BIP能显著增加大鼠脑IRI后外周血EPCs数量，减轻脑损伤程度，改善脑缺血的预后。与Patschan等[13]研究结果相反，考虑可能与缺血组织，预缺血方式、EPCs标记方法等不同有关。BIP组较MCAO组及SO组出现新生血管的时间早，且数目多，因而推测BIP能够促进脑IRI大鼠更早更多地形成新生血管。此外，BIP组、MCAO组外周血EPCs数目与新生血管密度呈正相关，说明BIP可通过增加外周血中EPCs的量来促进缺血区脑组织血管新生，与之前的研究结果基本一致[10，14]。

图2 各组大鼠缺血区脑组织新生血管密度（200×）图中棕色完整圆形或类圆形管腔即为一个新生血管，如红色箭头所示。A、B：分别表示5 d、7 d SO组、MCAO组、BIP组新生血管。C：各组新生血管密度比较。与SO组比较,*P＜0.01；与MCAO组比较,#P＜0.01

总之，BIP能促进大鼠脑IRI后EPCs的动员，从而增加缺血区脑组织血管新生，减轻脑损伤程度，保护脑功能。因而如何利用缺血预处理扩增EPCs数目，并安全有效的应用于缺血性卒中的治疗等问题有待进一步研究解决。

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The effects of brain ischemic preconditioning on peripheral blood endothelial progenitor cells and neovas⁃cularization in rats

.ZHANG Xudong,WANG Ye,LIU Ran,WANG Na,BI Guorong.Department of Neurology,the Affiliat⁃ed Sheng Jing Hospital of China Medical University,Shenyang 110000,China.Tel:024-96615.

ObjectiveTo investigate the effects of brain ischemic preconditioning(BIP)on peripheral blood EPCs and neovascularization in ischemic brain tissue in rats with cerebral ischemia reperfusion injury(IRI).MethodsOne hundred and eight male SD rats were randomly divided into three groups:SO group(n=36),MCAO group(n=36)and BIP group(n=36).Neurological function assessment was conducted at 0 h before MCAO-reperfusion,3 h,24 h and 3 d,5 d as well as 7 d after MCAO-reperfusion(n=6 for each group in each time point).Flow cytometry was used to calculate the number of EPCs.Immunohistochemical staining was used to detect the capillary density.Results①Although neurologi⁃cal deficit scores were significantly decreased in both BIP and MCAO groups after 3 h following MCAO-reperfusion,the scores were much lower in BIP group than in MCAO group（5 d:1.00±0.63;7 d:1.00±0.63,P＜0.05）.②The numbers of EPCs were decreased in MCAO group while was increased in BIP group at 3 h after MCAO-reperfusion.The numbers of EPCs were significantly higher in BIP group than in MCAO group（24 h:0.58±0.07;3 d:0.80±0.10;5 d:0.68±0.05;7 d:0.52±0.03,P＜0.01）.③The new blood vessels could be detected at 3 d in BIP group and 5 d in MCAO group after MCAO-reperfusion.The numbers of new blood vessels were significantly higher in BIP group than MCAO group（5 d: 14.53±3.44;7 d:41.40±5.62,P＜0.01）.④Pearson analysis showed a positive correlation between EPCs and capillary density(5 d:r=0.855,P＜0.01;7 d:r=0.946,P＜0.01).Conclusion BIP can improve EPCs mobilization and function, which may contribute to neovascularization in the ischemic brain tissue.

Ischemic preconditioning Ischemia-reperfusion injury Endothelial progenitor cells Neovasculariza⁃tion

R741

A

2014-07-01）

（责任编辑:李立）

表1 14例患者临床特征及治疗效果

编号术前评分术后6个月评分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 3 1 6 6 8 5 1 0 0 2 3 8 2 1 1 1 1 2 1 3 1 4性别/年龄男/ 5 9男/ 6 4男/ 5 7男/ 5 1男/ 7 1女/ 4 1男/ 3 5男/ 6 1男/ 5 0男/ 5 4男/ 5 6女/ 3 0男/ 4 7男/ 5 6定位L 9 C 2 T 1 0 L 3 L 2 T 9 T 9 T 7 T 2 T 8 T 1 1 T 9 T 4 T 1 0症状/体征尿急，下肢肌力4级头痛，S A H，四肢肌力4级尿急，下肢肌力3级持续便秘，下肢肌力3级持续尿失禁，下肢肌力2级下肢肌力2级偶有便秘，尿潴留，下肢肌力3级偶尔便秘，下肢肌力3级下肢肌力4级持续尿失禁，下肢肌力2级尿潴留，下肢肌力2级持续便秘及尿潴留，下肢肌力2级尿潴留，下肢肌力2级偶有便秘及尿潴留，下肢肌力4级病程1 4 d 4 d 2月5月1 9月1 2月2 3月7月1月2 9月7月4 8月7 d 3月治疗G l u b r a n胶O n x y胶O n y x胶O n y x胶G l u b r a n胶G l u b r a n胶弹簧圈2个+ G l u b r a n胶O n y x胶O n y x胶G l u b r a n胶G l u b r a n胶O n y x胶G l u b r a n胶G l u b r a n胶0 7 1 8 8 1 0 8 5 0 2 0 7 4 1 0 0 1

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.01.003

☆ 辽宁省科学技术计划项目（编号：2014021070）

* 中国医科大学附属盛京医院神经内科（沈阳110000）

（E-mail:bigr@sj-hospital.org）