人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理学和病原学特点

刘相波

禽流感病毒属于甲型流感病毒[1]。人感染禽流感是由禽流感病毒引起的人类疾病，根据禽流感病毒对鸡和火鸡的致病性不同，可将其分为低/非致病性、中、高三级[2]。由于禽流感病毒的血凝素结构等特点，一般感染禽类，在病毒复制过程中，出现基因重配，导致病毒结构出现改变，获得感染人的能力，最终导致人感染禽流感疾病的发生[3]。近年来，禽流感不仅造成了人类的伤亡，同时还对家禽养殖业造成了重创[4]。近年来先后在朝鲜、越南、泰国、韩国、日本、中国等10多个亚洲国家爆发H5N1高致病性禽流感病毒，引起全球的高度关注[5]。此次研究对在2008年1月-2014年1月中国内地人禽流感患者25例进行研究，对其病理组织学、超微结构及病因学特点进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2008年1月-2014年1月中国内地人禽流感患者25例作为研究对象，其中男16例，女9例，年龄22~86岁，25例患者均符合《人感染禽流感诊断方案》中的标准，根据患者流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可作出人感染H5N1禽流感诊断。流行病学史不详的患者，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果，从患者呼吸道分泌物标本中分离出禽流感病毒，或禽流感病毒核酸检测为阳性，或动态检测双份血清禽流感病毒特异性抗体阳转或呈4倍或以上升高[6]。

1.2 方法

1.2.1 胸腔局部解剖 对已死亡的1例患者进行胸腔局部解剖，摘除患者气管、双肺及心脏。

1.2.2 病理组织学制片与观察 使用4%甲醛对标本进行固定，使用石蜡包埋，然后连续切片，常规HE染色，然后在光学显微镜下对病理学组织进行观察。

1.2.3 组织化学染色 Macchiavello病毒包含体染色和网织纤维染色。

1.2.4 免疫组织化学染色 采用单克隆抗体CK、CD68、CD20、CD8、CD4、CD3、S-100，EnVisionTM二步法染色，然后在光学显微镜下对其进行观察。

1.2.5 电镜制片与观察 使用2.5%预冷戊二醛对组织标本进行固定，1%锇酸后固定，使用树脂包埋，然后将其超薄切片，使用乙酸铀-柠檬酸铅进行双重染色，然后使用透射电镜进行观察。

1.2.6 病原体分离培养鉴定、全基因组序列测定及动物致病性观察 细胞培养特性和培养细胞电镜观察；RT-PCR测定与部分基因序列分析；血清学试验；全基因组序列测定和分析比较；新分离禽流感病毒动物致病性观察。

2 结果

2.1 大体观察 对行胸部局部解剖的患者观察发现，该名患者左侧胸腔内有黄色浑浊液体约400 mL，其左侧胸腔内有少量淡黄色液体，该名患者壁胸膜外观呈现淡红色。气管黏膜充血，并且气管腔内有少量淡红色分泌物。患者左肺上下叶外观呈现出广泛性实变状，呈暗红色，其切面有粉红色泡沫状液体流出；左肺呈现出淡粉红色，散在斑片状暗红色区。心包内存在少量的淡黄色液体。患者心脏外观正常。

2.2 光镜检查

2.2.1 肺脏 左肺脏主要表现为广泛性肺实变，显著的肺水肿和肺出血及坏死。急性弥漫性肺泡损伤表现为肺泡上皮细胞增生，核增大，染色质浓聚，部分肺泡上皮细胞可以看见核异型性及核分裂象。患者肺泡腔内有大量的蛋白性渗出液，大量的淋巴细胞、巨噬细胞、红细胞，少量的中性粒细胞及变性坏死脱落的肺泡上皮细胞以及多核或合体样肺泡细胞，并且伴有明显的透明膜形成；肺泡隔没有明显的增宽，有部分的小血管壁亦呈现纤维素性坏死，并且有少量的血栓形成。有部分区域的肺泡隔已经出现较为严重的损毁及坏死，融合成片，并且伴有大量的中性粒细胞浸润。左肺病变较重，又肺病变较轻，肺组织内出血、充血呈灶状或片状分部。肺泡腔内有大量的巨噬细胞、淋巴细胞、红细胞及少量的水肿液、中性粒细胞等改变，有透明膜形成。支气管：黏膜中可以看见有淋巴细胞核巨噬细胞浸润；部分小支气管出现坏死，并且充满了炎性渗出物。

2.2.2 心脏 心包小血管充血。心肌间质水肿，少量淋巴细胞浸润。

2.3 免疫组织化学

2.3.1 肺脏 增生和脱落的肺泡上皮细胞及肺泡腔内的合体和多核细胞均呈现CK阳性反应。巨噬细胞呈现CD68阳性染色；只有少量的淋巴细胞CD3为阳性，标记B细胞的抗体CD79a及CD20均呈现阴性。SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体染色呈阴性。

2.3.2 心脏 心肌间质可以看见CD68阳性细胞浸润，并且可看见有少量的CD3阳性淋巴细胞浸润。

2.4 组织化学染色 （1）病毒包涵体染色：少量肺泡上皮细胞质内存在嗜酸性染色球形颗粒。（2）网织纤维染色：患者肺部坏死区域内肺泡壁网织纤维出现断裂，崩解消失。

2.5 电镜检查 Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮存在明显的细胞肿胀，并且细胞表面微绒毛减少，肺泡表面活性物质膜消失，并且能够观察到细胞凋亡和坏死。Ⅱ型肺泡细胞核体积增大，胞质内空泡形成，能够看见线粒体及内质网肿胀扩张。胞质内板层小体及早期病例相比数量增加。肺泡间隔内血管内皮红细胞出现肿胀及空泡变性，肺泡间隔和肺泡腔内可看见巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞和脱落的上皮细胞。在肺泡Ⅱ型上皮细胞及血管内皮细胞可以看到A型流行性感冒病毒样颗粒，多数呈现出球形，有囊膜，大小约为80~120 nm，高电子密度核心居中的C型病毒颗粒数量较多，低电子密度核心的A型病毒颗粒数量较少。

2.6 病原体分离培养鉴定

2.6.1 病原体的分离培养 将血浆标本接种Vero细胞16 h，观察到细胞出现病变，24 h后，CPE达到4+。经0.2 μm孔径的滤膜过滤后分别接种Vero细胞，出现CPE，与未经过过滤的样品无差别。除Vero细胞外，接种MDCK细胞，在MDCK细胞进行试验时出现病变时间相对于Vero细胞较早。2.6.2 培养细胞电镜形态学观察 在细胞外能够看到大量的病毒颗粒，并且有明显的突起，细胞内可见少量的病毒。

2.6.3 RT-PCR测定 RT-PCR测定与部分基因序列分析均扩增出A型流感病毒的部分M和HA基因片段。扩增测序的M基因片段核苷酸序列与禽流感病毒的同源性为96%。HA基因片段核苷酸序列与禽流感病毒的同源性为97%。

2.6.4 血清学试验 抗禽流感病毒特异血清H5N1、H9N1、N7N7特异血清。采用酶标抗体染色法、间接免疫荧光染色、血凝抑制试验。使用鸡抗禽流感病毒H5、H7、H9特异抗体进行酶标染色，然后分离病毒与鸡抗禽流感病毒H5N1亚型特异抗体均呈现出阳性反应。免疫酶标染色、血凝抑制试验均与H5N1亚型特异抗体呈现出强阳性反应。与SARS的特异抗体的反应均呈现出阴性。

3 讨论

人禽流行性感冒是由A型禽流感病毒的某些亚型毒株所造成的患者出现急性呼吸道传染病，患者病死率较高，并且尚无有效的治疗[7-8]。目前对有关人禽流感病原学、流行病学及其检测的研究已经有了进展，但关于人禽流感的发生及发展的病理过程及临床特点还没有定论，需要进一步的探索[9-10]。

此次研究使用电镜、光镜、免疫组织化学、组织化学方法对25例患者临床表现为多器官衰竭和急性呼吸窘迫的高致病性禽流感病毒H5N1亚型感染病例进行观察和研究，从而研究人感染高致病性禽流感病毒H5N1的病理学和病原学特点。

人感染禽流感病毒后，病毒在体内的潜伏期约为1周，临床表现为发热>39 ℃、气促、呼吸困难、呼吸窘迫等；部分患者会出现呕吐、腹泻、恶心等表现；症状较为严重的患者肺部病变发展较为快速，出现大片实变阴影，呈重症急性肺炎改变，可能会出现急性呼吸窘迫、胸腔积液、多器官功能衰竭、肺出血等症状，患者病死率较高[11-12]。

综上所述，高致病性A型禽流感病毒会导致患者出现严重急性病毒性肺炎，肺水肿、肺实变、明显的出血性坏死性炎症等病理改变为其主要特征。电镜检查可见A型禽流感病毒样颗粒。研究人禽流行性感冒的病原学和病理学特点，为将来的人禽流感临床诊断和治疗方案提供了理论基础和病理学基础。

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