β2肾上腺素能受体基因多态性与早发重症肌无力关系研究

王莉莉张运贺茂林

·论 著·

β2肾上腺素能受体基因多态性与早发重症肌无力关系研究

王莉莉*张运*贺茂林*

目的探讨β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor,β2-AR)16位点基因多态性与不同临床表型的早发重症肌无力（myasthenia gravis,MG）的关系。方法105例MG患者，其中起病年龄≤40岁的早发MG为48例。根据胸腺影像将早发MG患者分为胸腺正常组(13例)、胸腺增生组(22例)和胸腺瘤组（7例），未知6例。根据性别分为女性组(31例)和男性组(17例)，根据首发症状分为OMG组(29例)和GMG组(19例)，根据伴发其他自身免疫疾病情况分为伴发(10例)和不伴发(33例)其他自身免疫性疾病组，未知5例。PCR产物直接测序方法检测相对应的两组间β2-AR基因16位点多态性分布差异。结果胸腺正常的早发MG患者16位点基因型以Arg/ Arg（53.8%）为主，胸腺增生以Arg/Arg（54.6%）为主，胸腺瘤以Arg/Gly（71.4%）为主，3组间3种基因型分布差异无统计学意义(χ2=5.657，P=0.226)。女性早发MG患者16位点基因型以Arg/Arg（58.1%）为主，男性早发MG患者以Arg/Gly（58.8%）为主，组间差异有统计学意义(χ2=6.064，P=0.048)。首发OMG组以Arg/Arg（48.3%）基因型为主，GMG组Arg/Arg（42.1%）和Arg/Gly（47.4%）比例相似，组间差异无统计学意义(χ2=1.623，P=0.444)。伴发其他自身免疫性疾病组以Arg/Arg（80.0%）为主，不伴发组以Arg/Gly（39.4%）为主，组间差异有统计学意义(χ2= 6.394，P=0.041)。结论β2-AR基因16位点基因多态性与不同性别的早发型MG相关；与伴发其他自身免疫性疾病的早发型MG相关。

重症肌无力 β2肾上腺素能受体 基因多态性 单核苷酸

重症肌无力(myasthenia grads，MG)是累及神经肌肉接头的神经系统自身免疫性疾病。MG的发病机制还未完全清楚，神经内分泌免疫网络学说是近年来国际上神经系统自身免疫性疾病发病机制研究的热点。β2-肾上腺素能受体（β2-adrener⁃gic receptor,β2-AR）是一种在体内广泛分布的G蛋白偶联受体，介导交感神经系统调控免疫系统的功能。我们既往的研究发现β2-AR16位点基因多态性主要与晚发型MG相关,与早发型MG无关[1]。但β2-AR16位点基因多态性与不同临床表型的早发MG是否相关还未阐明。我们探讨β2-AR基因多态性与早发MG不同临床表型的关系，寻找早发MG不同临床表型的可能机制，为不同临床表型的早发MG药物治疗提供新的研究靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象所有入组MG病例均来自2002～2012年在首都医科大学附属北京世纪坛医院神经内科门诊和病房患者，诊断明确的重症肌无力患者共105例，其中早发型MG48例，女性31例，男性17例。年龄中位数37岁（4～52岁）。胸腺增生MG22例，胸腺瘤7例，胸腺正常13例，胸腺影像未知6例。眼肌型发病者29例，全身型发病者19例。伴发其他自身免疫性疾病者10例（伴发Graves病和桥本甲状腺炎共9例、类风湿关节炎1例），不伴发其他自身免疫性疾病者33例,未知5例。Graves病是指患者具备高代谢的症状和体征；甲状腺肿大；血清TT4、FT4增高和TSH减低。具备以上3项诊断即可成立。桥本甲状腺炎指甲状腺弥漫性肿大；甲状腺功能正常或减低；血清甲状腺球蛋白（thyroglobulin,TG）抗体和甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase,TPO）抗体滴度显著升高。具备上述3项诊断可成立。胸腺异常为影像学诊断结果。本研究得到首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会批准。全部受试者均已签署知情同意书。

1.2 MG诊断标准[2]和排除标准①骨骼肌无力，有典型活动后加重、休息后减轻或“晨轻暮重”特征；疲劳试验阳性；②新斯的明试验阳性；③肌电图检查显示低频重复电刺激波幅递减和(或)单纤维肌电图颤抖(jitter)增宽；④血清AChR抗体增高。MG入组标准：所有患者符合MG诊断标准①，并且就诊时至少符合MG诊断标准②③④中的任意一条。MG排除标准：①妊娠患者；②合并心脏、肺脏、肝脏、肾脏等器官功能不全者。

1.3 研究方法①DNA的提取：德国QIAGEN试剂盒法提取外周静脉EDTA抗凝血DNA。②PCR产物直接测序方法：β-AR上游引物为5’-CAGC⁃CAGTGCGCTTACCTGC-3’,下游引物为5’-CA⁃CAGCACAT CAATGGAAGTC-3’。PCR反应体系为50 μL,含有DNA模板4 μL；20 pmol/μL浓度的上、下游引物各0.4 μL；2×PCR mix 25 μL（包括EasyTaq DNA聚合酶、dNTP和优化的反应缓冲液）；ddH2O20.2 μL。PCR反应条件:94℃预变性5 min,然后开始循环：94℃变性40 s,58℃退火60s,72℃延伸60 s,35个循环,最后在72℃延伸5min。将PCR产物原液纯化后应用ABI3730测序仪测序以确定个体基因型。

1.4 统计学方法应用SPSS22软件对数据进行分析。组间等位基因和基因型显著性比较采用χ2检验。检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 β2-AR 16位点基因型β2-AR 16位点精氨酸（Arg）被甘氨酸（Gly）所取代[3]。共检出16多态位点的3种基因型(Arg/Gly、Arg/Arg、Gly/Gly,见图1所示)。早发MG临床表型各组的基因多态分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 β2-AR16位点基因多态性与早发MG患者胸腺异常的关系首先比较早发MG患者16位点的3种基因型在胸腺正常组、胸腺增生组和胸腺瘤组中的分布差异。如表1所示，β2-AR16位点3种基因型在3组的分布经卡方检验，差异无统计学意义。3组的16位点等位基因Arg16、16Gly间差异无统计学意义。

2.3 β2-AR16位点基因多态性与不同首发症状早发MG患者的关系比较16位点的3种基因型在早发OMG起病组和GMG起病组中的分布差异。如表1所示，β2-AR16位点3种基因型在OMG和GMG的分布经卡方检验，差异无统计学意义。两个组的16位点等位基因Arg16、16Gly在两组之间差异无统计学意义。

图1 β2-AR 16位点突变基因测序图（箭头标记处为突变位点）

表1 β2-AR16位点基因多态性与早发MG患者不同临床表型的关系[n(%)]

2.4 β2-AR16位点基因多态性与不同性别早发MG患者的关系观察β2-AR16位点基因型在女性和男性早发MG患者分布的差异，结果如表1所示，χ2值为6.064，P值为0.048。三种基因型差异有统计学意义。等位基因频率差异无统计学意义。2.5 β2-AR16位点基因多态性与MG患者是否伴发其他自身免疫性疾病的关系为观察哪种基因型早发MG患者易伴发其他自身免疫性疾病,我们将MG患者分为伴发其他自身免疫性疾病组和不伴发其他自身免疫性疾病组，比较两组间16位点基因型差异，结果（见表1）显示χ2值6.394，P值0.041。等位基因频率差异无统计学意义。

3 讨论

我们的研究探讨了β2-AR基因多态性与早发MG不同临床表型的关系，初步揭示了早发MG不同临床表型的可能机制。我们的研究结果显示β 2-AR基因16位点基因多态性与不同性别的早发型MG相关，与伴发其它自身免疫性疾病的早发型MG相关，与伴发胸腺异常的早发型MG无关，与不同首发症状的早发MG无关。

我们的研究发现女性早发MG患者16位点基因型以Arg/Arg为主，男性早发MG患者以Arg/Gly为主。既往国外研究结果显示早发女性MG患者Arg16纯合子明显高表达，这与我们的研究结果一致[4]。

胸腺瘤多见于晚男性MG患者[5],迄今为止尚无早发型MG胸腺异常与β2-AR16位点基因型关系的报道。我们研究结果显示胸腺正常的早发MG患者16位点基因型以Arg/Arg为主，胸腺增生以Arg/Arg为主，胸腺瘤以Arg/Gly为主，但差异均无统计学意义。既往国外研究发现胸腺瘤组Arg/ Arg基因型明显高于健康对照组。胸腺增生组Arg/Arg和Gly/Gly比例明显高于健康对照组[4]。我们既往研究发现MG患者胸腺瘤、胸腺增生和胸腺正常组间上述三种基因型分布均无显著性差异[1]。

我们研究结果还显示首发OMG组以Arg/Arg基因型为主，GMG组Arg/Arg和Arg/Gly比例相似。OMG与GMG组间三种基因型分布无显著性差异。既往研究显示MG患者与健康对照组比较Arg/Arg差异显著，这种差异主要与GMG包括由OMG转化来的GMG相关，与单纯OMG无关[4]。目前尚无早发型MG不同首发症状与β2-AR16位点基因型关系的报道。

既往研究发现伴发其他自身免疫性疾病的MG患者与不伴发其他自身免疫性疾病的MG患者相比有独特的临床特征，如常多发生于女性，常伴有胸腺增生，轻度全身型表型多见[6,7]。伴发的其它自身免疫性疾病包括甲状腺异常、类风湿性关节炎、格林巴利综合征[8]等，其中甲状腺功能异常最多见。我们分析了伴发与不伴发其他自身免疫性疾病的早发型MG患者β2-AR16位点基因型分布的差异，结果显示伴发组以Arg/Arg为主，不伴发组以Arg/Gly为主，组间差异有统计学意义。这种β2-AR16位点基因型分布的差异是否与伴发其他自身免疫性疾病的MG患者的临床特点相关还需要进一步研究。目前国内外也尚无伴发其他自身免疫性疾病的早发型MG与β2-AR16位点基因型关系的报道。

我们研究证明了β2-AR 16位点基因多态性与早发MG性别差异有关，并证明了该位点多态性与早发MG伴发其他自身免疫性疾病相关。但该位点基因型分布差异与早发MG不同临床表型关系的机制尚待阐明。这可能与影响β2-AR活性或淋巴细胞表面分子相关。既往研究发现β2-AR16氨基酸位点多态性改变了受体表达和功能，从而影响了疾病的易感性及临床表现多样性[9]。Arg16是否通过引起β2-AR活性改变进一步影响机体的免疫功能有待进一步研究证实。

国内外大量研究已经证明，β2-AR16位氨基酸位点多态性影响β2-AR激动剂的疗效。国内研究发现携有Glyl6患者对舒喘灵的治疗效果较携有Arg16的患者差[10]。国外研究已经发现β2-AR受体激动剂特布他林可以改善MG患者症状[11]，我们的研究证实了Arg16纯合子与女性早发MG的关系以及与伴发其它自身免疫性疾病的早发MG的关系，也为β2-AR受体激动剂应用于治疗上述两类患者提供了理论依据。

我们的研究还有一定的缺陷，首先是病人来源相对单一，例数较少。第二是本研究伴发自身免疫性疾病的患者多以甲状腺异常为主，其他自身免疫性疾病少见。还需要后续进一步扩大研究来证实目前结论。

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The relationship between β2-adrenergic receptor polymorphisms and early onset Myasthenia Gravis.

WANG Lili,ZHANG Yun，HE Maolin.Department of Neurology,Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Bei⁃jing 100038，China.Tel:010-63926556.

ObjectiveTo explore the correlation of β2-adrenergic receptor(β2-AR)polymorphisms(Arg16Gly) with early onset Myasthenia Gravis(MG).MethodsForty-eight with age less than 40 years at disease onset were divided into three groups:normal thymus(13 cases),thymic hyperplasia(22 cases)and thymoma(7 cases)groups according to the thymus histology.These patients were further divided into different subgroups including female(31 cases)and male groups(17 cases)based on the gender,OMG(29 cases)and GMG(19 cases)groups according to the symptom of disease onset and groups associated with(10 cases)or without(33cases)other autoimmune diseases Or with unknown causes(5 cases).The genotypes of β2-AR in 48 early onset MG were determined by gene sequencing.ResultsArg/Arg was more common in early MG patient with normal thymus(53.8%）and thymic hyperplasia（54.6%）whereas Arg/Gly was more common in thymus group（71.4%）.The difference in distribution of the genotypes between the three groups was not statis⁃tically significant(χ2=5.657，P=0.226).Arg/Arg was more common in early female MG patient(58.1%)and Arg/Gly was more common in male MG patients(58.8%).The difference in distribution of the genotypes between the two groups wasstatistically significant(χ2=6.064，P=0.048).Arg/Arg was more common in early OMG patient(48.3%).Arg/Arg(42.1%) and Arg/Gly(47.4%)were equal common in GMG patients.The difference in distribution of the genotypes between the two groups was statistically significant(χ2=1.623，P=0.444).Arg/Arg was more common in early MG patient associated with other autoimmune diseases(80.0%).Arg/Gly was more common in MG patients without other autoimmune diseases (39.4%).The difference in distribution of the genotypes between the three groups was statistically significant(χ2=6.394，P=0.041).Conclusionβ2-AR gene polymorphism in position 16 is associated with gender and other autoimmune diseas⁃es in patients with early onset of MG.

Myasthenia gravis β2-adrenergic receptor Polymorphism Single nucleotide

R746.1

A

2014-09-08）

（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.06.007

* 首都医科大学附属北京世纪坛医院神经内科（北京100038）