高强度聚焦超声治疗对裸鼠皮下胶质瘤VEGF、PCNA表达以及细胞凋亡的影响☆

肖文峰李俊霍钢翟安林郑履平

·论 著·

高强度聚焦超声治疗对裸鼠皮下胶质瘤VEGF、PCNA表达以及细胞凋亡的影响☆

肖文峰*李俊*霍钢△翟安林*郑履平△

目的通过观察高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)对裸鼠皮下人胶质瘤模型作用后血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear anti⁃gen，PCNA)蛋白的表达和细胞的凋亡，探讨HIFU治疗后对交界区及照射区细胞增殖和细胞凋亡的影响。方法建立18只裸鼠左右背部皮下胶质瘤模型，用频率9.7MHz，焦距4.5mm，声强2500W/cm2的HIFU连续照射20s。按照射后动物处死时间随机分为7d组，14d组，30d组，每组各6只裸鼠即12个皮下胶质瘤组织；应用免疫组化法检测HIFU作用后第7d、14d、30d照射区、交界区、正常区VEGF、PCNA蛋白的表达；应用原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测照射区、交界区、正常区的凋亡细胞。结果免疫组化观察到，各时刻点交界区及正常区均有VEGF及PCNA表达并检测到凋亡染色阳性的细胞，照射区均无PCNA蛋白的表达及未检测到凋亡细胞。第7d时交界区VEGF阳性细胞百分数(23.79%±3.11%)低于正常区(46.16%± 2.43%)(F=110.03,P＜0.05)；照射区VEGF阳性细胞百分数(10.94%±3.95%)低于正常区(46.16%±2.43%)(F=272.80，P＜0.05)。第14d时交界区VEGF阳性细胞百分数(17.17%±2.89%)低于正常区(43.47%±3.77%)(F=152.05,P＜0.05)；第30d时交界区VEGF阳性细胞百分数(9.27%±2.08%)低于正常区(44.58%±3.34%)(F=274.1,P＜0.05 2)。交界区的PCNA标记指数(PCNA labeling index，PCNA LI)(33.04%±4.31%)在第7d时低于正常区(65.15%±3.85%)，(F=242.46,P＜0.05)；在14d时为(21.05%±1.96%)低于正常区(62.99%±3.34%)(F=413.52,P＜0.05)；在30d时为(6.36%± 0.51%)低于正常区(62.07%±18.07%)(F=729.59,P＜0.05)。第7d时交界区的凋亡指数(apoptotic index，AI)(26.10%± 4.54%)高于正常区(1.43%±0.35%)(F=216.22,P＜0.05)。14d时交界区的凋亡指数AI(65.70%±1.14%)高于正常区(1.82%±0.31%)(F=1448.64,P＜0.05)；30d时交界区的凋亡指数AI(82.02%±3.98%)高于正常区(2.52%±0.29%)(F= 2244.33,P＜0.05)。结论在本实验设定参数及声学剂量情况下,HIFU除了对照射区组织产生直接的杀灭作用外，还能抑制交界区的细胞增殖以及诱发细胞凋亡的发生。

高强度聚焦超声 胶质瘤细胞增殖细胞凋亡

☆ 重庆市卫生局资助项目（编号：04-2-196）

△ 重庆医科大学附属第一医院神经外科

在前期研究中，我们不仅观察到高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)对照射区的肿瘤组织具有确切、可靠的杀灭作用，能使照射区组织细胞发生典型的凝固性坏死改变，还可观察到坏死区与正常区之间有一个区域，在此区域内没有观察到胶质瘤细胞发生典型的凝固性坏死，而是出现组织浅染、细胞间隙变大、细胞皱缩等改变，并且随着观察时间的延长，出现细胞大小不等，胞浆浓缩，呈强嗜酸性等改变，我们称之为交界区[1]。在此研究中，我们将通过免疫组化及原位末端标记法，观察HIFU作用后皮下胶质瘤组织7d、14d、30d照射区、交界区及正常区血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)蛋白表达以及凋亡细胞的检测，进一步研究HIFU对胶质瘤的治疗作用及治疗的安全性。

1 材料与方法

1.1 研究对象4～6周龄裸小鼠18只，每只质量20～30 g，雌性，由重庆医科大学实验动物中心提供。胶质瘤细胞株SHG-44由苏州医学院附属第二医院黄强教授建系，由第三军医大学病理教研室提供。用1640培养液（含10%新生小牛血清、青霉素G 100mg/mL、链霉素100mg/mL）于37℃、5%CO2条件下常规培养,取同一代对数生长期细胞，用培养液重悬细胞并调细胞密度为5×107mL-1；局部消毒条件下于裸小鼠左右背部皮下各射0.2mL细胞悬液，建立裸鼠皮下胶质瘤模型。18只裸鼠全部成瘤,成瘤率100%。按HIFU作用后动物处死时间即7d，14d，30d分为3个组，每组各6只裸鼠即12个皮下胶质瘤组织。

1.2 方法CZF-II型超声治疗仪，由重庆海扶技术有限公司研制，重庆医科大学超声工程研究所提供，由功率源、治疗探头及循环脱气水降温系统三部分组成。本研究采用的治疗探头频率为9.7MHZ,直径9.5mm，焦距4.5mm，脉冲1 MHZ，最大输出功率5W,焦点处声强2500W/cm2。裸鼠固定于特制鼠板上，肿瘤表面涂以超声耦合剂，输入治疗参数，将探头置于涂有超声耦合剂的肿瘤表面，采用以上治疗参数连续照射20s。于照射后7d、14d、30d时处死实验动物取皮下胶质瘤组织制作常规石蜡切片，行免疫组化：PCNA、VEGF检测以及TUNEL法细胞凋亡检测。观察不同时刻点照射区、交界区、正常区PCNA、VEGF和细胞凋亡情况。VEGF阳性染色呈黄色或棕黄色，局限于细胞浆，血管内皮细胞也可见阳性染色；在每张组织切片阳性染色均匀区域，随机选取l0个高倍视野(×400)，计算每个视野内100个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，即阳性细胞的百分数并取平均值。PCNA阳性染色定位于细胞核内，呈棕黄色或棕褐色颗粒或弥漫性分布；TUNEL法检测的凋亡细胞，其阳性染色定位于细胞核，呈棕黄色弥漫性分布；在高倍(×400)显微镜下观察，在每张组织切片阳性反应均匀的区域，随机选取10个视野，计数1000个细胞统计阳性细胞的百分数，分别以PCNA阳性细胞所占的比例以及凋亡细胞的百分数作为PCNA标记指数(PCNA labeling index，PC⁃NA LI)和凋亡指数(apoptotic index，AI)。

1.3 统计学方法数据用±s表示，数据处理在SAS8.2上完成。统计学方法采用两因素方差分析。检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 正常区、交界区及照射区VEGF的表达在正常区域，肿瘤细胞VEGF染色呈棕黄色弥漫性分布，肿瘤滋养血管的内皮细胞也成阳性反应；在交界区域，肿瘤细胞VEGF表达率明显降低，VEGF阳性的肿瘤细胞大多呈浅黄色，血管内皮细胞未见着色；在照射区域，第7d时可见细胞大体轮廓尚存，并有VEGF蛋白阳性表达，第14d、30d时未见有完整的细胞形态，仅可见细胞残片和纤维结缔组织的黄色背景(图1)。第7d时交界区VEGF阳性细胞百分数(23.79%±3.11%)低于正常区(46.16%± 2.43%)(F=110.03,P＜0.05)；照射区VEGF阳性细胞百分数(10.94%±3.95%)低于正常区(46.16%± 2.43%)(F=272.80，P＜0.05)。第14d时交界区VEGF阳性细胞百分数(17.17%±2.89%)低于正常区(43.47%±3.77%)(F=152.05,P＜0.05)；第30d时交界区VEGF阳性细胞百分数(9.27%±2.08%)低于正常区(44.58%±3.34%)(F=274.1,P＜0.05 2)。见表1。2.2正常区、交界区及照射区PCNA的表达PC⁃NA表达于细胞核内，呈棕黄色或棕褐色颗粒或弥漫性分布。HIFU作用后7d时，交界PCNA LI (33.04%±4.31%)低于正常区(65.15%±3.85%)(F= 242.46,P＜0.05)；在14d时为(21.05%±1.96%)低于正常区(62.99%±3.34%)(F=413.52,P＜0.05)；在30d时为(6.36%±0.51%)低于正常区(62.07%±18.07%)(F= 729.59,P＜0.05)。照射区未观察到PCNA阳性表达的细胞，细胞全部发生凝固性坏死(图2，表1)。

图1 A：HIFU作用后7 d，正常区（下）及交界区（上）VEGF的表达（×400）;B：HIFU作用后7 d，照射区VEGF的表达（×400）；C：HIFU作用后30 d，正常区（上）及交界区（下）VEGF的表达（× 400）

2.3 正常区、交界区及照射区凋亡的测定 本实验采用TUNEL法，对凋亡细胞进行检测，细胞核被染成棕黄色的细胞为凋亡细胞。第7d时交界区AI(26.10%±4.54%)高于正常区(1.43%±0.35%)(F= 216.22,P＜0.05)。14d时交界区的凋亡指数AI (65.70%±1.14%)高于正常区(1.82%±0.31%)(F= 1448.64,P＜0.05)；30d时交界区的凋亡指数AI (82.02%±3.98%)高于正常区(2.52%±0.29%)(F= 2244.33,P＜0.05)。照射区未观察到凋亡细胞，细胞全部发生凝固性坏死(图3，表1)。

图2 A：HIFU作用后7 d，正常区（下）及交界区（上）PCNA的表达（×400）；B：HIFU作用后14 d，正常区（右）及交界区（左）PCNA的表达（×400）；C：HIFU作用后30 d，正常区（左）及交界区（右）PC⁃NA的表达（×400）；D：HIFU作用后30 d，照射区（右）及交界区（左）PCNA的表达（×400）

图3 A：HIFU作用后7 d，正常区（左）及交界区（右）凋亡细胞的观察（×400）；B：HIFU作用后14 d，交界区凋亡细胞的观察（×400）；C：HIFU作用后30 d，交界区凋亡细胞的观察（×400）

表1 HIFU作用后第7、14、30d时，正常区、交界区、照射区VEGF、PCNA的表达及细胞凋亡指数

3 讨论

高强度聚焦超声在短时间内，使焦域温度迅速升高到65℃以上，从而使焦域内组织发生不可逆的凝固性坏死。李发琪等[2]采用频率1.6 MHz，焦距120mm，焦点处声强0～27000W/cm2的HIFU作用新鲜离体牛肝脏发现，焦点处温度为74.4℃± 1.5℃，焦点外6mm处温度为47.5℃，9mm处为27.5℃。何申戌等[3]分别以活体猪肾、肝、膀胱、结肠壁、卵巢及大血管作为靶组织进行体外聚焦热疗实验，发现离焦点6.8 mm处温度在60℃左右, 13.6 mm处温度在45℃～50℃，20.4 mm处温度在40℃左右。可见，HIFU作用时，温度以焦点为中心向周围扩散；焦域外仍有损伤作用并随离焦点距离的增大而减弱。在焦域内，温度能迅速升高到65℃以上，使组织发生凝固性坏死；在焦域外，由于温度下降迅速，不能使组织发生即刻的凝固性坏死，而是引起一个亚急性的损伤区域我们称之为交界区。正如我们在前期研究中发现，在HIFU照射的焦域内，胶质瘤组织发生了典型的凝固性坏死改变；在HIFU作用后第7d时，可观察到坏死区与正常区之间的交界区的形成，在交界区没有观察到胶质瘤细胞发生典型的凝固性坏死，而是出现组织浅染、细胞间隙变大、细胞皱缩等改变，并且随着观察时间的延长，出现细胞大小不等，胞浆浓缩，呈强嗜酸性等改变。所以，我们在此研究通过免疫组化及原位末端标记法，进一步研究HIFU作用后7d、14d、30d照射区、交界区和正常区VEGF、PCNA蛋白的表达及细胞凋亡的测定。

大量研究表明，VEGF在胶质瘤中有表达，与胶质瘤新生血管的生成、肿瘤的生长相关，并且还可反应胶质瘤的恶性程度[4,5]。本研究发现，HIFU作用后第7d时，照射区VEGF有表达，VEGF阳性细胞百分数为10.94%；Wu等[6]用HIFU对23名乳腺癌患者进行治疗，行免疫组化染色，结果他们也发现在治疗区域存在VEGF阳性染色，其阳性表达率为30%。可见HIFU作用后，照射区肿瘤细胞的VEGF蛋白仍部分存在，但可观察到细胞核发生明显的固缩、碎裂等改变，说明细胞已失去活力。HIFU作用后第7d、14d、30d时，交界区VEGF阳性细胞百分数与正常区比较差异有统计学意义，说明HIFU能抑制交界区胶质瘤细胞的血管生成，从而抑制肿瘤的生长。

PCNA是一种分子量为36 kU的多肽，仅在增殖细胞中合成，在肿瘤细胞中明显增加。用免疫组化方法标记PCNA并通过阳性细胞记数而得到的PCNA LI，被认为是评价和反映细胞增殖的指标。PCNA LI越高，意味着处于S期的细胞越多，肿瘤增殖活性越高。刘振林等[7]通过对50例胶质瘤标本研究，结果发现肿瘤分级及恶性程度越高，PCNA标记指数(PCNA labeling index，PCNA LI)就显著增高；李利敏等[8]也研究发现，PCNA的表达随胶质瘤恶性程度的增加而升高。因此PCNA可被用于研究肿瘤的细胞增殖和判断其恶性程度，对肿瘤的治疗和预后的判断有重要的意义。牛陵川等[9]研究发现在高强度聚焦超声作用后，照射区内乳腺癌组织发生凝固性坏死，PCNA不表达；而残留的肿瘤组织细胞增殖活性明显降低。我们的研究中发现，HIFU作用后，照射区胶质瘤细胞PC⁃NA LI为0；交界区胶质瘤细胞PCNA LI随着时间的延长逐渐降低，与正常组比较差异有统计学意义。说明HIFU不仅能直接杀灭肿瘤细胞，还能通过降低肿瘤的增殖活性来抑制肿瘤的生长，从而达到治疗肿瘤的目的。

TUNEL法是一种研究细胞凋亡的方法，该方法又被称为DNA缺口末端标记（DNA nick end la⁃beling），也称原位加尾技术（in situ tailing）。研究表明，TUNEL法的敏感性高，尤其在凋亡的早期，且标记强度大，背景染色低，所需时间短。所以我们选择用TUNEL法来获得HIFU治疗胶质瘤后各个区域的凋亡指数即AI。朱学强等[10]研究高强度聚焦超声治疗乳腺癌后靶区肿瘤细胞的病理学变化和细胞凋亡时发现，23例病人HIFU治疗后靶区乳腺癌组织发生凝固性坏死，肿瘤细胞出现胞浆浓缩，核固缩，核碎裂等变化，但未检测到凋亡染色阳性的肿瘤细胞。我们也研究发现，在HIFU作用后的照射区，未观察到凋亡染色阳性细胞，而是典型的凝固性坏死改变的细胞；但我们还发现，在照射区以外的交界区则出现了大量的凋亡细胞，并且随着观察时间的延长，AI逐渐变大；各时刻点与正常组比较差异具有统计学意义。这又进一步说明了HIFU不仅能直接杀灭肿瘤细胞，还能诱导照射区外一定范围的组织细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤的生长。

综上所述，HIFU除了对照射区组织产生直接的杀灭作用外；还能降低交界区细胞VEGF、PCNA蛋白的表达以及诱发细胞凋亡的发生，但其具体机制尚不明了。HIFU作用后交界区的产生，增加了HIFU的作用范围，认识到这一点，对HIFU治疗的组织生物学焦域及安全性的研究具有重要的意义。

[1]肖文峰,霍钢,郑履平,等.高强度聚焦超声对裸鼠皮下人胶质瘤的治疗作用[J].中国神经精神疾病杂志,2008,34(4): 208-211.

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[4]高晓明,杜贻庆.PTEN、VEGF和Ki-67在人脑胶质瘤中的表达及其意义[J].2012，10(31):486-488.

[5]孙荣辉,徐国政.VEGF、MMP-9在人脑胶质瘤中的表达及其意义[J].中国临床神经外科杂志,2010,15(5):273-277.

[6]Wu F,Wang ZB,Cao YD，et al.Expression of Tumor Antigens and Heat-Shock Protein 70 in Breast Cancer Cells After High-Intensity Focused Ultrasound Ablation[J].Annals of Surgi⁃cal Oncology,2006,14(3):1237-1242.

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[10]朱学强,伍峰,周强，等.高强度聚焦超声治疗乳腺癌的机理研究[J].四川医学,2004,25(9):971-973.

（责任编辑:甘章平）

The effect of high intensity focused ultrasound on VEGF and PCNA expression and apoptosis of subcutane⁃ous neurogliocytoma in nude mice

.XIAO Wengfeng，LI Jun,HUO Gang,ZHAI Anlin,ZHENG lvping.Department Of Neurosurgery,The Second Affiliated Hospital Of North Sichuan Medical College，NO.56 YueJin Road，Mianyang 621000, China.Tel:08162348021.

ObjectiveTo explore the effects of high intensity focused ultrasound(HIFU)on cell multiplication

Neurogliocytoma High Intensity Focused Ultrasound Cell Multiplication Apoptosis

R739.410.6

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.07.007

2015-01-13）

* 川北医学院附属第二医院神经外科（绵阳621000）