HPLC法测定葛根总黄酮固体脂质纳米粒的载药量及包封率

熊月路+崔蕴慧+曾天骏+巫嘉华+李冬玲+王治平+王一飞

[摘要]目的 建立HPLC法同时测定葛根总黄酮固体脂质纳米粒中4种异黄酮类成分的包封率及载药量。方法 采用RP-HPLC法，Kromasil C18（4.6mm × 250mm， 5μm）色谱柱；甲醇-0.1%枸橼酸溶液为流动相梯度洗脱；流速1.0mL/min，柱温40℃，检测波长250nm。采用高速离心法分离固体脂质纳米粒中游离药物。 结果 3-羟基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元线性关系良好，平均回收率分别为（100.28±2.52）%、（100.26±2.33）%、（100.08±3.35）%及（100.44±3.48）%。3批次葛根总黄酮固体脂质纳米粒中3-羟基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元的包封率分别为（84.35±0.45）%、（86.84±0.48）%、（89.52±0.86）%及（93.80±0.50）%，其载药量分别为（10.37±0.36）%、（14.19±0.52）%、（16.79±0.34）%及（20.00±0.97）%。 结论 本法简单快速、结果准确可靠，可同时测定葛根总黄酮固体脂质纳米粒4种成分的载药量与包封率。

[关键词]葛根总黄酮；固体脂质纳米粒；载药量；包封率

[中图分类号]TQ461 [文献标识码]B [文章编号]2095-0616（2014）20-54-05

Determination of drug loading and entrapment efficiency of pueraria flavonoids loaded solid lipid nanoparticles by HPLC

XIONG Yuelu1 CUI Yunhui2 ZENG Tianjun1 WU Jiahua1 LI Dongling1

WANG Zhiping1 WANG Yifei3

1. School of Pharmacology， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China； 2. The First Affiliated Hospital of Jinan University， Guangzhou 510632， China； 3. Institute of Biological Medicine， Jinan University， Guangzhou 510632， China

[Abstract]Objective To establish a method for simultaneous determination of drug loading and entrapment efficiency of four isoflavones in pueraria flavonoids （PF）loaded solid lipid nanoparticles（PF-SLN）. Methods HPLC determination was performed on a Kromasil C18 column （4.6mm×250mm， 5 μm） and detected at 250 nm. The mobile phase was consisted of methanol and 0.1% citric acid solution with gradient elution. Flow-rate was 1.0mL/min， and column temperature was 40℃. The free drugs in solid lipid nanoparticles were separated by high-speed centrifuge. Results 3-hydroxypuerarin， puerarin， daidzin and daidzein had a good linear relation and the average recoveries were （100.28±2.52）%， （100.26±2.33）%， （100.08±3.35）% and （100.44±3.48）%， respectively. The entrapment efficiency of 3-hydroxypuerarin， puerarin， daidzin and daidzein in PF-SLNs were （84.35±0.45）%， （86.84±0.48）%，（89.52±0.86）% and （93.80±0.50）%， and drug loading were （10.37±0.36）%， （14.19±0.52）%， （16.79±0.34）% and（20.00±0.97）%， respectively. Conclusion Results obtained showed that its a convenient， accurate and reliable method. The method has been successfully applied to determination of drug loading and entrapment efficiency of four isoflavonoids in PF-SLNs.

[Key words]Pueraria flavonoids； Solid lipid nanoparticles； Drug loading； Entrapment efficiency

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根[1]。葛根总黄酮（Pueraria flavonoids，PF）是葛根的有效部位，具有活血化瘀之功，用于缺血性中风中经络恢复期瘀血痹阻脉络证。现代药理研究表明，PF具有抗血栓形成，抗细胞凋亡[2]，抗胰腺损伤[3]，抗偏头痛[4]及抗氧化应激[5-6]等作用。PF主要由葛根素（puerarin）、大豆苷元（daidzein），大豆苷（daidzin）、3-羟基葛根素（3-hydroxypuerarin）、染料木素（genistein）、染料木苷（genistin）等组成[7]。但PF的水溶性和稳定性均较差，其主要有效成分葛根素的生物利用度仅为3.95%[8]，严重制约其临床应用。为提高PF主要有效成分的生物利用度，有学者研究了固体分散体[9-10]、自微乳滴丸[11]及分散片[12]等，未见葛根总黄酮固体脂质纳米粒的相关研究报道。endprint

固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）由生理性脂质、表面活性剂和水组成，既具备聚合物纳米粒物理稳定性高、药物泄漏少等优点，又兼备脂质体、微乳等低毒性、规模化生产等优点，是一种极具发展前景的新型给药载体系统，而受到各发达国家的广泛重视。SLN可增强与生物膜的黏附性，延长胃肠道的黏附时间和滞留时间，有效地提高药物生物利用度[13-14]。

为提高PF溶解性、稳定性和生物利用度，本研究以PF为模型药物，采用高压均质技术[15-18]制备葛根总黄酮固体脂质纳米粒（PF-SLN）。载药量和包封率测定是制备SLN时处方筛选与质量评价的重要指标。为此，建立了HPLC同时测定PF-SLN中4种主要异黄酮类成分（3-羟基葛根素、葛根素、大豆苷及大豆苷元）的方法，为PF-SLN的临床前研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根素对照品购自中国食品药品检定研究院（含测用，批号 110752-200511），大豆苷元对照品购自上海同田生物（批号09020513，纯度≥99 %），3-羟基葛根素及大豆苷对照品由本实验室自制（熔点、比旋度、UV、MS 及NMR与文献一致，纯度均>95 %）；山嵛酸甘油酯（Compritol 888 ATO，批号135683）；吐温-80（上海国药集团化学试剂有限公司，批号F20091214）；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯；PF自制[19-21]，UV测得以葛根素计的总黄酮含量为62.19 %，HPLC测得3-羟基葛根素、葛根素、大豆苷及大豆苷元含量分别为1.04%、10.39%、1.46%及0.52%；PF-SLN由本实验室制备，批号分别为PFN130601，PFN130602，PFN130603。

1.2 仪器与设备

Waters 高效液相色谱仪（Empower Pro色谱数据工作站，996二极管阵列检测器，600 四元泵，717plus 自动进样器，在线脱气机）；高速分散机（IKA T18 basic.ULTRA-TURRAX？，德国）；高压均质机（APV-2000，德国）；高速离心机（Sigma 1-13）；电子天平（Sartourius，BP211D）；超纯水器（Millipore）。

1.3 方法1.3.1 PF-SLN的制备 采用高压均质法（high pressure homogenization technique，HPH）制备PFSLN。称取处方量的脂质及PF，在（85±2）℃水浴加热融化，混匀，为脂质相；另取处方量的吐温-80，加适量超纯水分散，置同温水浴中，为水相。在保温状态下，将水相倒入脂质相中，搅匀，先高速分散机4000 r/min分散5min（预试发现：低于5min，则需增大高压均质次数，才能制得合适粒径的混悬液；而超过5min，分散形成的泡沫过多，严重影响后续操作），得微乳，趁热用高压均质机均质15次（1500bar），即得PF-SLN。

1.3.2 供试溶液制备 （1）供试品溶液：精密吸取PF-SLN 0.5mL，置5mL量瓶中，加入30%乙醇溶液稀释至刻度，微孔滤膜（0.45μm）过滤，即得。（2）空白供试品溶液：按处方比例称取缺PF的脂质及表面活性剂，按PF-SLN的制备方法制得空白SLN，精密吸取0.5mL，置5mL量瓶中，加入30%乙醇溶液稀释至刻度，微孔滤膜（0.45μm）过滤，即得。（3）对照品溶液：精密称取各对照品适量，分别用甲醇制成每1mL中含3-羟基葛根素0.294mg、葛根素0.721mg、大豆苷 0.317mg、大豆苷元0.219mg的溶液，即得。临用时稀释或制成混合对照品溶液。

1.3.3 色谱条件 Kromasil 100-5C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，预柱（Security Guard，C18，4.0mm×3.0mm，Phenomenex）；以甲醇-0.1%枸橼酸溶液为流动相，梯度洗脱[17]；流速1.0mL/min；柱温40℃；进样量10μL；检测波长250nm。

1.3.4 系统适应性试验 精密吸取“1.3.2”项下的空白供试品溶液、供试品溶液及混合对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，分析，即得。

1.3.5 方法学考察[22]（1）检测限及定量限：将各对照品色谱峰测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，分别以信噪比为 3∶1及 10∶1时注入仪器的量确定检测限和定量限。（2）线性关系考察：分别精密吸取上述对照品溶液适量，进样分析，分析结果以峰面积（Y）对对照品的进样质量（X，ng）进行回归。（3）精密度试验：精密吸取各对照品溶液，注入液相色谱仪分析，重复 6次。（4）重复性试验：精密量取PF-SLN（批号PFN130601）0.5mL，6份，按“1.3.2”项下供试品溶液制备方法制备，进样分析。（5）稳定性试验：于 0、1、2、4、8h，分别精密吸取供试品溶液（批号PFN130601），注入色谱仪分析。（6）加样回收试验：精密量取已知含量的PF-SLNA（批号PFN130601）0.25mL，6份，分别精密加入相当量的对照品溶液，挥干溶剂，同“2.2.1”供试品溶液制备方法处理，测定。

1.3.6 PF-SLN包封率及载药量测定 （1）游离PF（WF）测定：精密吸取PF-SLN 1.0mL，置离心管中，离心（14 000r/min）30min，吸取上清液，注入色谱仪，分析，即得。（2）PF-SLN总药量（WT）测定：精密吸取PF-SLN 0.5mL，置5mL量瓶中，加入30%乙醇溶液稀释至刻度，微孔滤膜（0.45μm）过滤，分析，即得。endprint

按公式：包封率=（WT-WF）/WT×100% ，载药量=（WT-WF）/WS×100%（WS为载体材料及药物的总量），分别计算各成分的包封率及载药量。

2 结果与分析

2.1 系统适应性试验

由分析结果可知，3-羟基葛根素、葛根素、大豆苷和染料木苷吸收峰分离良好，脂质及表面活性剂对各成分的测定无干扰。见图1。

2.2 方法学考察

（1） 检测限及定量限：3-羟基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元的检测限和定量限分别为9.41～29.40ng、8.65～28.84ng、10.14～34.87ng及7.01～21.90ng。（2）线性关系：3-羟基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元的回归方程分别为Y=2889.3X+811 837、Y=4892.7X-429 161、Y=4151.7X-69 893及Y=7807.3X-43 979，线性范围分别为81.28～406.4ng、670.4～3352ng、136.96～684.8ng及31.04～155.2ng，相关系数均大于0.9995。（3）精密度：所得各吸收峰峰面积的标准偏差（RSD）分别为1.03%、1.18%、0.97%及1.26%。表明仪器精密度良好。（4）重复性：所得各成分含量的RSD分别为1.37%、1.09%、0.83% 及1.03%。表明本法重复性良好。（5）稳定性：测得各成分吸收峰峰面积的RSD分别为1.39%、1.11%、1.06% 及0.93%。表明供试品溶液在8h内稳定。（6）加样回收试验：见表1。试验结果表明，回收率符合规定。2.3 包封率及载药量测定

3批样品测定结果见表2。

3 结论

由分析结果可知，葛根总黄酮固体脂质纳米粒中4种异黄酮类成分的包封率及载药量存在一定的差别，依次为大豆苷元>大豆苷>葛根素>3-羟基葛根素。含量相对较低的3-羟基葛根素、大豆苷元及大豆苷的包封率均超过80%，尤其是大豆苷元的包封率大于90%，而含量较高的葛根素的包封率并非最高。PF各成分的包封率及载药量与化合物的极性呈负相关关系，即成分的极性越小，其包封率及载药量越大，而与其含量大小无关。

测定药物包封率时供试品溶液处理方法有多种。透析法操作简便、费用低廉，但较费时；凝胶柱色谱法操作繁琐、费时，用高浓度醇性洗脱剂分离游离药物时易破坏树脂；高速离心法是在离心力的作用下，使大分子和小分子分离。由于操作准确、简便、耗时短，样品不必稀释，不存在被包封药物泄漏等的问题，可有效分离游离药物与固体脂质纳米粒。因此，选用高速离心法制备样品测定包封率。

研究表明，该方法操作简便快速、结果准确可靠，可同时测定PF-SLN中不同成分包封率和载药量，为新制剂临床前研究奠定了良好的基础。

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（收稿日期：2014-05-21）endprint