温控辅助离子液体分散液液微萃取-高效液相色谱检测果汁中杀菌剂残留

张 琰，赵其阳，张耀海,5，焦必宁,3,4,5,*

（1.中国农业科学院柑桔研究所/西南大学柑桔研究所，重庆 400712；2.西南大学园艺园林学院，重庆 400715；3.农业部柑橘产品质量安全风险评估实验室，重庆 400712；4.农业部柑桔及苗木质量监督检验测试中心，重庆 400712；5.国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712）

杀菌剂广泛用于防治作物、蔬菜和水果种植和采后贮运销过程中由病原微生物引起的植物病害。目前常用有机杀菌剂种类主要有酰胺类、三唑类、咪唑类、甲氧基丙烯酸酯类、嘧啶类、抗生素类等。如新型杀菌剂嘧菌酯和咯菌腈分属甲氧基丙烯酸酯类和吡咯类，三唑酮、氯苯嘧啶醇、嘧菌环胺、咪鲜胺和烯唑醇涵盖三唑类、嘧啶类和咪唑类。这5 类杀菌剂在苹果、梨、葡萄、柑橘等果树中主要用于防治由子囊菌亚门和担子菌亚门真菌引起的植物病害，如白粉病、黑星病、锈病、黑粉病等。随着这些杀菌剂的广泛使用及新型复配药剂的问世，其在世界农药市场的领域逐步扩大，也带来了由于农药不合理使用引起的一系列危害，造成果蔬及相关产品中农药残留超标，威胁人类健康及环境安全[1-2]。为此，食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）、欧盟（European Union Legislation，EU）及各国政府都制定了更为严格的农药残留限量标准，其中GB 2763—2014《食品中农药最大残留限量》[3]规定嘧菌酯在柑橘中最大残留限量（maximum residue limit，MRL）为1 mg/kg，在葡萄中为5 mg/kg；三唑酮在柑橘和苹果中MRL为1 mg/kg，在梨中为0.5 mg/kg；氯苯嘧啶醇在苹果、梨和葡萄中MRL为0.3 mg/kg，在桃中为0.5 mg/kg；嘧菌环胺在梨中MRL为1 mg/kg；咪鲜胺在柑橘类水果中MRL为10 mg/kg，柑橘中为5 mg/kg，在苹果和葡萄中为2 mg/kg；烯唑醇在柑橘中MRL为1 mg/kg，在苹果和葡萄中为0.2 mg/kg，梨中为0.1 mg/kg，但均未针对果汁饮料产品制定其最大残留限量。因此，亟需建立更简单、快速、高效、灵敏的农药残留检测方法。

检测杀菌剂残留的方法主要有高效液相色谱法[4]、气相色谱法[5]和色谱-质谱联用技术[6-7]。样品前处理在农药残留分析检测中起到关键作用，传统的前处理方法如液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和固相萃取等，需消耗大量有毒试剂、操作繁琐、处理时间长且成本高。近年来一些微型化样品前处理方法被成功应用于食品或环境中农药残留的检测，如单滴微萃取[8]，该方法成本低，溶剂消耗少，但微滴不易控制，操作耗时；中空纤维液相微萃取[9]具有灵敏度高、选择性好的优点，但其较低的迁移速率导致操作耗时较长；固相微萃取[10]由于其样品用量少，使用方便、快捷已被广泛应用于环境及食品中农药残留检测，但目前可供其使用的固定相涂层种类不多，限制了该方法的应用范围及联用技术；搅拌棒吸附萃取[11]是一种新型的固相微萃取技术，萃取容量高、固定相体积大，但涂层的制备和使用多需要手动操作，对操作者技术水平要求高；超分子化学范畴的分子印迹技术[12]具有高亲和性和选择性，对恶劣环境的耐受能力强，越来越引起科研工作者的兴趣，但是分子印迹聚合物的合成较为复杂且该方法多用于快速检测。

本研究利用温控辅助离子液体DLLME结合高效液相色谱-二极管阵列检测器（high performance liquid chromatography with photodiode array，HPLC-PDA）技术，建立了快速检测多种果汁（苹果汁、梨汁、葡萄汁、桃汁和橙汁）中嘧菌酯、咯菌腈、三唑酮、氯苯嘧啶醇、嘧菌环胺、咪鲜胺和烯唑醇7种常用杀菌剂残留的方法。重点考察了影响离子液体分散液液微萃取的多种因素，如萃取剂、分散剂、溶解温度、萃取时间和离心时间，并将此方法应用于实际样品测定，涵盖了市场上主要果汁类型。本方法简便、快速、价格低廉、重复性良好，能够满足不同果汁中多种杀菌剂残留同时快速检测和确证的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果汁、梨汁、葡萄汁、桃汁和橙汁购买于重庆市超市。

1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[C4MIM][PF6]）（＞9 8%，CAS号：174501-64-5）、1-甲基-3-辛基咪唑六氟磷酸盐（[C8MIM][PF6]）（＞98%，CAS号：304680-36-2）、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[C6MIM][PF6]）（≥98%，CAS号：304680-35-1） 上海安谱公司；甲醇、乙腈、丙酮（均为色谱纯） 德国CNW Technologies有限公司；嘧菌酯（99.0%，CAS号：131860-33-8）、咯菌腈（98.5%，CAS号：131341-86-1）、氯苯嘧啶醇（99.0%，CAS号：60168-88-9）、嘧菌环胺（99.0%，CAS号：121552-61-2）、咪鲜胺（98.0%，CAS号：67747-09-5）、烯唑醇（99.0%，CAS号：76714-88-0）标准品 德国Dr.Ehrenstorfer公司；三唑酮（99.7%，CAS号：43121-43-3）标准品 美国Sigma Alorich公司。

1.2 仪器与设备

e2695高效液相色谱仪（配有PDA检测器及Empower色谱工作站） 美国Waters公司；Milli-Q A10超纯水器美国Millipore公司；CL31/CL31R多用途离心机 美国Termo Fisher公司；HH-S数显恒温水浴锅 金南仪器制造有限公司；MDF-382E（N）超低温冰箱 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取5.00 mg（精确至0.01 mg）嘧菌酯、咯菌腈、三唑酮、氯苯嘧啶醇、嘧菌环胺、咪鲜胺、烯唑醇标准品，用甲醇溶解并定容至50.00 mL，配成100 mg/L标准品母液，于－50℃避光低温保存。临用前，将100 mg/L标准溶液放置室温，用甲醇分别稀释配成10 mg/L和1 mg/L混合标准溶液，保存于4℃冰箱。

1.3.2 标准曲线的绘制

(3)检测平道制动距离。以不超载为基本前提，让无轨胶轮车沿道路正常行驶，将车速控制为20 km/h，采取制动之后用卷尺对制动距离进行测量，所得数值即平道制动距离。

准确移取适量混合标准溶液，分别用甲醇稀释成一系列质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的混合标准品工作溶液，在优化后的方法条件下测定，以测得的各个杀菌剂积分峰面积为纵坐标，质量浓度（mg/L）为横坐标绘制标准曲线。

1.3.3 前处理方法

果汁样品（橙汁稀释5倍，其他果汁不稀释）于10 000 r/min离心5 min后，取5.00 mL加入到15 mL尖底具塞离心管中，加入50 μL质量浓度为0.1 mg/L 7种杀菌剂标准溶液，然后将含有60 μL[C6MIM][PF6]（萃取剂）的0.8 mL甲醇（分散剂）快速注入离心管中，快速振荡、涡旋1 min形成乳浊体系，然后将离心管移至恒温水浴锅中以80℃加热10 min，待离子液体完全溶解在水相中，迅速转移至冰浴中萃取15 min，以4 000 r/min离心5 min，离子液体相沉淀于试管底部，去除上层清液，取离子液体相用甲醇按照1∶1稀释，涡旋，用于液相色谱分析。

1.3.4 色谱条件

色谱柱 Waters XBridgeTM-C18Column（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相组成：A（水）+B（甲醇），采用梯度洗脱；梯度洗脱程序：A的初始比例为60%，在0～15 min线性降低至20%，15～25 min保持20%，25 min提高至60%，并保持至40 min。流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：213 nm；进样量：10 μL。

2 结果与分析

2.1 标准溶液图谱

在优化后的方法条件下，7种杀菌剂混合标准溶液的色谱图见图1，根据相对保留时间并结合待测化合物的特征吸收波谱进行定性。由图1可以看出，7个杀菌剂物质的峰形良好，分离度高。

图1 杀菌剂标准溶液色谱图（质量浓度为5 mg/L）Fig.1 Chromatogram of fungicide standard solution at 5 mg/L

2.2 仪器参数评估

在优化的色谱条件下对系列质量浓度的混合标准溶液进行检测，其线性范围和精密度结果见表1。其中，嘧菌酯和咯菌腈在20～10 000 μg/L范围内其积分峰面积与质量浓度呈现良好的线性关系，氯苯嘧啶醇、嘧菌环胺、咪鲜胺和烯唑醇4种杀菌剂在50～10 000 μg/L范围内线性关系良好，7种杀菌剂的相关系数均达0.999以上；该方法日内保留时间相对标准偏差（relative standard deviation，RSD，n=6）为0.03%～0.06%，峰面积RSD（n=6）为1.04%～5.20%；日间保留时间RSD（n=6×6）为0.10%～0.19%，峰面积RSD为0.54%～7.96%。结果表明该方法线性范围宽、上机测定重复性好。

表1 7种杀菌剂的线性范围、相关系数及精密度Table1 Linearity ranges, correlation coefficients and accuracy for seven fungicides

2.3 IL-DLLME萃取条件优化

为提高萃取效率，需对DLLME操作条件进行优化。在优化实验条件过程中样品加标水平均为0.1 mg/L，采用萃取回收率即萃取到沉淀相中目标物占总目标物的百分比和富集倍数即浓缩倍数，为沉淀相中目标物质量浓度与最初水相中目标物质量浓度之比作为萃取性能评价参数。

2.3.1 萃取剂类型选择

合适的萃取剂应该满足水溶性低、不易挥发、密度比水大、与目标物性质匹配等特性，这样才能保证获得较高萃取效率。本研究比较了3种离子液体，包括[C4MIM][PF6]（密度1.37 g/mL）、[C6MIM][PF6]（密度1.30 g/mL）和[C8MIM][PF6]（密度1.23 g/mL）对7种杀菌剂的萃取效果。所有样品溶液均加入含有60 μL离子液体的甲醇1 mL。结果发现[C4MIM][PF6]作为萃取剂时离心管底部没有产生沉淀，因此不再做深入研究；当以[C6MIM][PF6]和[C8MIM][PF6]两种离子液体为萃取剂时离心管底部均能产生沉淀，其萃取回收率如图2所示，可见[C6MIM][PF6]对目标物的萃取效率整体上要优于[C8MIM][PF6]，故本实验选择[C6MIM][PF6]为萃取剂。

图2 萃取剂类型对回收率的影响Fig.2 Effect of extraction solvent type on fungicide recovery

2.3.2 萃取剂体积选择

图3 萃取剂体积对回收率的影响Fig.3 Effect of extraction solvent volume on fungicide recovery

萃取剂体积直接影响IL-DLLME方法的富集效率[21]。本实验比较了包含不同体积离子液体[C6MIM][PF6]（40、50、60、70、80 μL）的1 mL甲醇对萃取效率的影响。从图3可以看出，萃取回收率随着萃取剂体积的增大而呈增加趋势，在60 μL和70 μL时获得最大萃取回收率，之后萃取回收率随萃取剂体积增大而降低可能是因为过量的萃取剂会吸附于离心管壁，造成这部分萃取剂中目标物不能被沉淀到离心管底部。当离子液体用量增大，沉淀相体积也随之增大，则沉淀相中目标物的质量浓度会下降，影响方法灵敏度。因此在满足残留检测要求的回收率范围内，权衡既能保证较高的富集倍数同时又能少用离子液体量后，确定[C6MIM][PF6]用量为60 μL。

2.3.3 分散剂类型选择

分散剂类型也是影响萃取效率的关键因素之一。合适的分散剂必须同时满足和离子液体、水相互溶，在整个萃取过程中使离子液体均匀分散于水相中并形成良好的乳浊体系[22]。基于上述条件，本实验选择甲醇、乙腈、丙酮作为分散剂，系列实验均加入含有60 μL离子液体的1 mL各种分散剂。从图4可以看出，甲醇作为分散剂其回收率和富集倍数整体效果最佳，可能因为萃取剂在甲醇中的分配系数要大于其他分散剂，萃取剂被分散成细小液滴，从而增大萃取效率[23]。所以选用甲醇作为本实验的分散剂。

图4 分散剂类型对回收率影响Fig.4 Effect of dispersive solvent type on fungicide recovery

2.3.4 分散剂体积选择

分散剂体积直接影响离子液体在水相中溶解程度、决定沉淀相体积、影响萃取回收率。本实验考察了含有60 μL离子液体的甲醇（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL）对萃取率的影响，结果见图5。由图5可知，当分散剂用量为0.8 mL时萃取回收率最佳，当分散剂体积从1.0～1.2 mL时萃取回收率降低。因为，甲醇用量少时，不能形成良好的乳浊体系，因此回收率较低；而甲醇用量较大时，分析物在水相中的溶解度增大，同样会导致回收率较低。所以，甲醇用量选0.8 mL。

图5 分散剂体积对回收率的影响Fig.5 Effect of dispersive solvent volume on fungicide recovery rate

2.3.5 溶解温度选择

温度是TCA-IL-DLLME过程中关键步骤，可直接影响萃取回收率。低温限制离子液体及目标物在水相中的扩散速率，减小目标物与离子液体和水相的接触面积，造成萃取回收率偏低；高温增大离子液体对目标物的萃取速率同时也增大目标物从离子液体的迁出速率，若萃取速率小于迁出速率也会导致萃取回收率降低。实验选择50、60、70、80、90℃验证温度对目标物萃取回收率的影响（图6）。从图6可以看出，当温度为80℃时萃取回收率最高，当温度高于80℃可能造成萃取速率小于迁出速率回收率随之降低。因此，溶解温度选择80℃。

图6 溶解温度对回收率的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on fungicide recovery

2.3.6 萃取时间选择

萃取时间指离心管放入冰水浴到离心的时间间隔。冰浴可使溶解在水相中的离子液体形成分散相，并将目标物收集到分散相中。本实验所选萃取时间为5、10、15、20、25 min。从图7可以看出，在15 min时达到萃取平衡，当超过15 min时萃取回收率逐渐降低，可能是长时间萃取导致部分离子液体溶于水相中。因此，萃取时间选择15 min。

图7 萃取时间对回收率的影响Fig.7 Effect of extraction time on fungicide recovery

2.3.7 其他因素选择

在IL-DLLME实验中，离心时间对萃取效率也有一定影响。离心可导致相分离，将含有目标物的离子液体沉积到试管底部，方便提取。本实验做了相关研究，发现当离心时间为5 min时，萃取回收率最高，当超过5 min时，回收率有所降低，可能由于离心时间过长离子液体相溶解于水相中，使目标物质量浓度降低，故选择5 min为最佳离心时间。

2.4 方法评估

在优化的最佳条件下，分别对不含目标物的5种果汁（橙汁稀释5倍，方法同1.3.3节）加标，加标水平分别为0.02、0.05 mg/L和0.10 mg/L，平行测定6次，计算其平均加标回收率，结果见表2。7种杀菌剂农药的平均加标回收率达到70.0%～116.2%，RSD为1.3%～9.8%，在信噪比为3时得到方法检出限在4.3～13.0 μg/L之间。与近年报道的IL-DLLME方法检测果汁和水样中杀菌剂残留的方法进行对比（表3），本方法使用温控辅助离子液体萃取方式检测果汁中杀菌剂残留，在增加样品对象保证较高富集倍数（64～101）的同时，氯苯嘧啶醇、嘧菌环胺、咪鲜胺和烯唑醇的回收率均有所提高，表明该方法具有良好的重复性和准确性。

表2 不同果汁3个水平加标下平均回收率和RSD（n=6）Table2 Mean recoveries and relative standard deviations for spiked fruit juice samples at three concentration levels (n= 6)

表3 现有IL-DLLME方法检测果汁、红酒和水样中杀菌剂方法的对比Table3 Comparison of existing methods for the analysis of fungicides in fruit juice, red wine and water by IL-DLLME

2.5 实际样品分析

在各大型超市随机抽取苹果汁、梨汁、葡萄汁、桃汁和橙汁样品共计20个，采用本方法进行检测，样品中均未检出杀菌剂农药残留，部分色谱图见图8。

图8 苹果汁样品DLLME萃取后空白（A）和加标0.1 mg/L（B）色谱图Fig.8 Chromatograms of blank apple juice sample (A) and spiked apple juice sample at 0.1 mg/L (B) after DLLME extraction

3 结 论

目前，离子液体DLLME已广泛应用于食品、环境等领域污染物检测，但研究大多集中于水样中污染物检测。本研究建立了温控辅助离子液体DLLME结合HPLC法检测多种果汁中7种杀菌剂残留的方法，方法操作简单、灵敏度高、富集倍数高、成本低、环保，能满足复杂基质如果汁样品中残留的检测要求，同时对拓宽离子液体DLLME方法应用领域也具有一定的指导、借鉴意义。

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