吸附树脂对蛹虫草黄酮纯化工艺条件优化

陈晓侠，宋 渊，张纪柏，王增利,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中国农业大学生物学院，北京 100193；3.国内贸易工程设计研究院，北京 100069）

蛹虫草（Cordyceps militaris）又名北虫草，与冬虫夏草是同属的药用真菌，是子囊菌亚门、麦角菌目、麦角菌科、虫草属的模式种[1]。我国是世界上最早认识并利用冬虫夏草的国家，早在公元前2000年就有了虫草的记载[2]，现在已经成为重要的中医药资源之一[3]，与冬虫夏草有着类似功效的蛹虫草在2009年被批准为新资源食品[4]。

近年来，蛹虫草生理活性、功能成分和人工培育等方面的研究成为新的热点。研究表明，蛹虫草具有抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、抗疲劳[7]、抗衰老[8]、免疫调节[9]、降血脂[10]、消炎和抗病毒[11]等生理作用，与冬虫夏草功能性相似；另外，冬虫夏草含有的腺苷、虫草素、虫草多糖、黄酮等功能性成分在人工培育的蛹虫草中均有存在，且含量相近甚至蛹虫草中更为丰富[12]，蛹虫草成为冬虫夏草的潜在替代品。

黄酮类化合物是一类以C6-C3-C6为骨架的化合物总称，包括黄酮、异黄酮、查耳酮等类，多数黄酮类化合物分子式中含酚羟基，显酸性，可溶于水、乙醇、甲醇及稀碱溶液等溶剂，可与Al3+发生螯合反应，反应形成的络合物在紫外光下呈现荧光[13]。黄酮类化合物是一类天然抗氧化剂，具有抗衰老[14]、免疫调节[15]、预防心血管疾病[16]等生理功效，并被列为保健食品的功能因子之一[17]。

黄酮类化合物分离纯化方法较多，常见的有铅盐沉淀法、氧化铝层析法、吸附树脂层析法等，尤其是吸附树脂柱层析因其上样量大、分离效果好、操作简单、树脂可以重复利用等优势，在黄酮分离纯化中得到广泛应用[18]。吸附树脂根据其极性不同可分为非极性、弱极性、中等极性、极性和强极性等多种类型，根据骨架不同可分为聚苯乙烯型、聚丙烯酸型等类型，在黄酮类化合物纯化中常用的吸附树脂包括AB-8[19]、D-101[20]、NKA-9[21]和NKA-Ⅱ[22]等类型。

Jiang等[23]利用树脂从蛹虫草中分离纯化得到一种具有抑制HIV病毒活性的黄酮类化合物，但并未对其纯化条件进行优化和进一步研究。本研究以蛹虫草中黄酮类化合物作为研究对象，探讨了黄酮类化合物纯化中常用的4 种吸附树脂对蛹虫草黄酮的分离效果，并对其中的一种理想树脂进行了纯化工艺的优化，对蛹虫草黄酮的分离纯化起到借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草子实体由北京市农林科学院培养获得，菌种号为SX-08。

芦丁标准品 美国Sigma公司；AB-8、D-101、NKA-9、NKA-Ⅱ吸附树脂（参数见表1） 南开大学化工厂；其他试剂（均为分析纯） 北京化工厂。

表1 实验用吸附树脂主要参数Table1 The main parameters of macroporous adsorption resins used in this study

1.2 仪器与设备

UV-5200紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；RE-5A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D循环水式真空泵 巩义市英峪仪器厂；HL-2恒流泵上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 吸附树脂预处理

树脂净品用2 倍体积的无水乙醇浸泡10 h，彻底排出空洞中的气泡并使其充分溶胀。去除乙醇后，树脂用去离子水洗涤至洗涤液无白色混浊且无醇味，后用2倍体积的5% NaOH溶液充分浸泡3 h。去除碱溶液后，树脂用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，后用2倍体积的5% HCl溶液充分浸泡3 h。去除酸溶液后，树脂用去离子水洗涤至洗涤液呈中性[24]，备用。

采用湿法进行吸附树脂装柱（树脂层析柱内径17 mm，长度500 mm），装柱体积为100 mL。

1.3.2 黄酮含量测定

1.3.2.1 黄酮含量工作曲线绘制

黄酮含量测定方法和标准曲线绘制参考文献[25]。准确称取芦丁标准品12.5 mg，用95%乙醇溶液溶解并定溶于25 mL棕色容量瓶中，摇匀得质量浓度为0.5 mg/mL的芦丁标准液，备用。分别精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于6 支20 mL刻度试管中，依次向试管中加入5% NaNO2溶液0.50 mL，混匀。静置6 min后，依次向试管中加入10% Al(NO3)3溶液0.50 mL，混匀。静置6 min后，依次向试管中加入4% NaOH溶液4.00 mL，用去离子水定容至10 mL，混匀。静置30 min后，以试剂为空白，利用分光光度计于510 nm波长处测定吸光度，绘制工作曲线。得芦丁含量X与吸光度Y的工作曲线：Y=1.164X－0.012 6，R2=0.998 4。

1.3.2.2 样品溶液中黄酮含量测定

取适量样品溶液，按照上述条件测定样品溶液的吸光度，根据工作曲线计算样品中的黄酮含量。

1.3.3 粗品溶液制备

蛹虫草干子实体粉碎后过60 目铁筛，用75%的乙醇溶液室温浸提2 次，第一次浸提料液比为1∶20（g/mL），浸提24 h，第二次浸提料液比为1∶15，浸提24 h。乙醇浸提液过滤除去残渣后得乙醇提取液，在40℃条件下真空浓缩乙醇提取液至浸膏状。用5% NaOH溶液重新溶解浸膏，过滤除去不溶物得黄酮碱提取液。向碱提取液中滴加浓盐酸至pH 5，静置1 h后，过滤去除酸溶物，收集沉淀，沉淀干燥后得黄酮粗品，黄酮粗品用75%乙醇溶液重新溶解，配成质量浓度为（1.188 4±0.001 6） mg/mL的黄酮母液，备用。

1.3.4 吸附树脂的筛选

1.3.4.1 吸附树脂静态吸附

准确称取活化并干燥后的4 种吸附树脂0.50 g，分别置于300 mL具塞三角瓶中，向各个三角瓶中依次准确加入黄酮母液30.0 mL。塞紧瓶塞后置于摇床上，25℃条件下振荡吸附24 h，转速为100 r/min。测定吸附24 h后母液中剩余黄酮的质量浓度，并按照公式（1）分别计算4种吸附树脂对黄酮的单位吸附量。

式中：Q为吸附树脂对黄酮的单位吸附量/（mg/g）；ρ0、ρ1分别为吸附前后母液中黄酮质量浓度/（mg/mL）；V为黄酮母液的加入量/mL；m为吸附质量/g。

1.3.4.2 吸附树脂解吸

去除1.3.4.1节中吸附后的残液，得到充分吸附了黄酮的吸附树脂，向具塞三角瓶中分别准确加入60.0 mL 95%的乙醇溶液，塞紧瓶塞后置于摇床上，25℃条件下振荡解吸24 h，转速为100 r/min。测定解吸24 h后解吸液中黄酮的质量浓度，并按照公式（2）分别计算4种吸附树脂对黄酮的解吸率。

式中：ρ2为解吸液中黄酮质量浓度/（mg/mL）；V为解吸液体积/mL；Q’为吸附树脂吸附的黄酮量/mg。

1.3.4.3 吸附树脂静态吸附动力学

准确称取预处理并干燥后的4种吸附树脂0.50 g，分别置于300 mL具塞三角瓶中，向各个三角瓶中准确加入黄酮母液30.0 mL。塞紧瓶塞后置于摇床上，25℃条件下振荡吸附，转速为100 r/min。每隔一定时间，吸取0.50 mL黄酮母液，测定母液中剩余黄酮的质量浓度，直至母液中剩余黄酮质量浓度趋于稳定。以树脂对黄酮的单位吸附量（mg/g）为纵坐标，以吸附时间（h）为横坐标，绘制静态吸附动力学曲线。

1.3.5 吸附树脂分离纯化蛹虫草黄酮工艺优化

以1.3.4节中筛选出的吸附树脂为实验对象，对蛹虫草中黄酮纯化工艺进行研究。

1.3.5.1 上样体积确定

分别准确吸取黄酮母液10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mL，用去离子水稀释至50.0 mL，上柱。母液上柱完毕后稳定吸附30 min，然后用大量去离子水淋洗，利用浓硫酸检测流出液中是否含糖，淋洗至流出液无色无糖。用大量95%乙醇溶液洗脱吸附树脂，洗脱速率为2 BV/h，收集黄酮洗脱液，流出液无色且与AlCl3和FeCl3溶液反应显阴性时结束洗脱。分别测定各组洗脱液的体积和黄酮质量浓度。按照公式（3）计算不同上样体积时黄酮的解吸率，并根据解吸率确定黄酮上样体积。

式中：ρ0、ρ’分别为母液和洗脱液中黄酮质量浓度/（mg/mL）；V、V’分别为母液和洗脱液的体积/mL。

1.3.5.2 淋洗液pH值确定

根据1.3.5.1节确定的上样体积，对黄酮母液进行上柱。上柱完毕后稳定吸附30 min，然后分别用pH值为2、3、4、5、6、7的淋洗液淋洗，利用浓硫酸检测流出液中是否含糖，淋洗至流出液无色无糖。用大量95%乙醇溶液洗脱吸附树脂，洗脱速率为2 BV/h，收集黄酮洗脱液，流出液无色且与AlCl3和FeCl3溶液反应显阴性时结束洗脱。分别测定各组洗脱液的体积和黄酮质量浓度。按照公式（3）计算淋洗液不同pH值条件下黄酮的解吸率，并根据解吸率确定淋洗液的pH值。

1.3.5.3 洗脱液体积分数确定

根据1.3.5.1节确定的上样体积，对黄酮母液进行上柱。上柱完毕后稳定吸附30 min，然后用1.3.5.2节中确定的淋洗液pH值淋洗，利用浓硫酸检测流出液中是否含糖，淋洗至流出液无色无糖。分别用80%、85%、90%、95%、100%乙醇溶液洗脱吸附树脂，洗脱速率为2 BV/h，收集黄酮洗脱液，流出液无色且与AlCl3和FeCl3溶液反应显阴性时结束洗脱。分别测定各组洗脱液的体积和黄酮质量浓度及干燥后干物质的质量。按照公式（3）计算不同洗脱液体积分数条件下黄酮的解吸率，并按照公式（4）计算不同洗脱液洗脱后黄酮纯度，最后确定洗脱液乙醇体积分数。

式中：ρ’为洗脱液中黄酮质量浓度/（mg/mL）；V’为洗脱液体积/mL；m为洗脱液干燥后干物质质量/g。

1.3.5.4 洗脱液体积确定

根据1.3.5.1节确定的上样体积，对黄酮母液进行上柱。上柱完毕后稳定吸附30 min，然后用1.3.5.2节中确定的淋洗液pH值淋洗，利用浓硫酸检测流出液中是否含糖，淋洗至流出液无色无糖。用1.3.5.3节中确定的洗脱液体积分数洗脱吸附树脂，洗脱速率为2 BV/h，收集黄酮洗脱液，每100 mL洗脱液收集1管，直至流出液无色且与AlCl3和FeCl3溶液反应显阴性时结束洗脱。测定各组洗脱液中黄酮质量浓度，绘制洗脱曲线，并确定洗脱液体积。

1.3.5.5 吸附树脂重复使用次数确定

根据1.3.5.1～1.3.5.4节确定的条件，在同一根吸附树脂柱上重复上柱、淋洗、洗脱，分别测定每次洗脱液中黄酮质量浓度，并计算黄酮回收率，当黄酮回收率低于60%时不再重复使用，最后确定同一根树脂柱的使用次数。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 吸附树脂筛选

2.1.1 吸附树脂静态吸附

由图1可见，极性较弱的AB-8和D-101两种树脂更容易吸附蛹虫草黄酮，单位吸附量均可达到60 mg/g左右，且无显著性差异（P＞0.05），极性树脂NKA-9和NKA-Ⅱ对黄酮的吸附能力较前两种树脂较弱（P＜0.05）。影响吸附树脂吸附能力的主要因素有吸附剂的极性和空间结构，本实验结果与刘国庆等[26]于大豆乳清废水中黄酮吸附特性的研究中结论一致，说明蛹虫草子实体中黄酮主要以苷元形式存在，极性相对较弱。

图1 树脂种类对蛹虫草黄酮单位吸附量的影响Fig.1 Adsorption quantities of flavonoids from Cordyceps militaris using different macroporous resins

2.1.2 吸附树脂解吸

图2 树脂种类对蛹虫草黄酮的解吸率的影响Fig.2 Desorption rates of flavonoids from Cordyceps militaris using different macroporous resins

由图2可知，AB-8和NKA-Ⅱ两种树脂吸附黄酮后更易于解吸，解吸率均达90%以上，D-101和NKA-9两种树脂的黄酮解吸率较前两者低（P＜0.05）。结合4种吸附树脂对黄酮的单位吸附量测定结果，可以发现AB-8树脂对蛹虫草黄酮有良好的吸附能力，并且易于解吸，较适宜选作纯化用树脂；D-101树脂对黄酮虽有良好的吸附能力，但解吸率较低，表明该树脂极性与蛹虫草黄酮极性更为相近；NKA-Ⅱ树脂虽有较高的解吸率，但对黄酮的吸附能力较弱，限制了蛹虫草黄酮分离纯化的效率；NKA-9树脂对蛹虫草黄酮既无良好的吸附能力，又不易于解吸，不适合本实验对蛹虫草黄酮的分离纯化。

2.1.3 吸附树脂静态吸附动力学曲线

吸附树脂对蛹虫草黄酮吸附动力学特性与后续分离纯化工艺有着密切关系，在吸附时间足够长时，部分效率较低的树脂也可能有较高的吸附量。为了进一步确定理想树脂种类，对4种吸附树脂进行了吸附动力学研究，并测定了各种树脂的吸附速率，见图3。AB-8和D-101两种树脂对蛹虫草黄酮均有很高的吸附速率，在0.5 h时均可达到饱和吸附，且单位吸附量无显著性差异（P＞0.05）；树脂NKA-9在吸附0.5 h后也接近其饱和吸附量，但较前两种树脂，单位吸附量较低（P＜0.05）；而树脂NKA-Ⅱ不但吸附饱和时单位吸附量较低，而且在4 h左右时才达到饱和吸附，吸附速率也较慢。说明NKA-9与NKA-Ⅱ树脂极性、空间结构与蛹虫草黄酮分子和空间结构不符[21]，吸附能力较弱，不利于蛹虫草黄酮的分离纯化。结合4 种吸附树脂静态吸附率和解吸率实验结果可知，AB-8吸附树脂对蛹虫草黄酮具有良好的吸附能力和较高的吸附速率，且易于解吸，是蛹虫草黄酮树脂分离纯化的理想树脂。同时，静态吸附动力学实验表明在上样30 min后，AB-8树脂即对黄酮达到稳定吸附的效果。

图3 不同树脂对蛹虫草黄酮的静态吸附动力学曲线Fig.3 Static adsorption dynamic curves of flavonoids from Cordyceps militaris using different macroporous resins

2.2 AB-8吸附树脂分离纯化蛹虫草黄酮工艺优化

2.2.1 上样体积确定

图4 不同上样体积条件下蛹虫草黄酮的回收率Fig.4 Recoveries of flavonoids from Cordyceps militaris using different sample volumes

实验中蛹虫草黄酮质量浓度为1.188 4 mg/mL，从图4可以看出，上样体积少于40 mL时，随着上样体积的增加，黄酮的回收率也随之增加；当上样体积超过40 mL后，回收率随着上样体积的增加而下降；在上样体积为40 mL时，黄酮的回收率最高（P＜0.05），达到82.82%。分析认为，在低上样体积时，树脂对黄酮的吸附作用使其难以完全解吸，造成洗脱不彻底，黄酮回收率较低，当上样体积过大时，树脂未能对黄酮完全吸附，并在淋洗过程中造成泄漏损失。因此，本实验中100 mL吸附树脂的黄酮溶液上样体积确定为40 mL，其中含有黄酮47.536 mg。

2.2.2 淋洗液pH值确定

图5 淋洗液不同pH值条件下蛹虫草黄酮的回收率Fig.5 Recoveries of flavonoids from Cordyceps militaris using different eluent pH values

黄酮分子中含有大量酚羟基，通常情况下显酸性，淋洗时，淋洗液pH值可以影响其分子的存在形式，进而影响树脂对黄酮的吸附能力。从图5可以看出，用不同pH值的淋洗液对树脂淋洗后，黄酮的回收率显著不同（P＜0.05）。黄酮回收率随着淋洗液pH值的上升呈现出先下降后上升再下降的趋势，淋洗液pH 5时，黄酮回收率最高，达到88.66%。

实验结果与骆党委[19]、李春美[27]等的研究结果不同，与石凤英等[28]在两色金鸡菊总黄酮纯化工艺中的研究结果一致，此种现象从另一角度印证说明蛹虫草中黄酮极性较弱，与苷元结合的形式存在有关。在pH 5时，黄酮类化合物呈分子态，极性较弱，与AB-8吸附树脂稳定吸附，不容易被淋洗液洗脱。因此，本实验确定分离纯化中淋洗液pH值为5。

2.2.3 洗脱溶剂体积分数确定

根据化合物的相似相容原理，与洗脱液的极性相近的化合物更容易被洗脱，理想的洗脱液应使目标化合物同时具有较高的纯度和回收率，但现实情况中难以达到，往往是在保证回收率的基础上尽可能提高目标化合物的纯度[27]。

图6 洗脱液不同体积分数条件下蛹虫草黄酮的回收率和纯度Fig.6 Recoveries and purities of flavonoids from Cordyceps militaris using different ethanol concentrations

实验中，未经AB-8吸附树脂分离纯化的黄酮粗品纯度为4.13%。从图6可以看出，经纯化后黄酮纯度均有不同程度的提高，但随着黄酮纯度的提高，回收率逐渐降低，说明在洗脱液洗脱过程中，杂质去除的同时会有黄酮化合物的部分损失，此时，应遵循在保证回收率的基础上尽可能提高纯度的纯化原则。经分析后认为，乙醇体积分数为85%时，黄酮的回收率达到77.85%，纯度达到17.24%，具有较高的黄酮回收率和纯度，确定其作为分离纯化的洗脱液体积分数。

2.2.4 洗脱液体积确定

吸附树脂的吸附作用使黄酮难以完全洗脱，延长洗脱时间可以提高黄酮的回收率，但同时也增加了有机试剂的使用量，造成经济和时间上的浪费，因此，确定适宜的洗脱液体积不仅可以保证黄酮有较高的回收率，也缩短了洗脱时间、减少了试剂的浪费。

图7 洗脱液中黄酮含量随洗脱液体积的变化Fig.7 Elution curves of flavonoids from Cordyceps militaris

从图7可以看出，每100 mL洗脱液中黄酮含量呈近似正态分布，经计算分析，500 mL洗脱液中黄酮总量为34.322 3 mg，占洗脱液中黄酮总量的92.27%，之后洗脱液中黄酮含量很低（P＜0.05），已不具有收集价值，因此，确定洗脱液体积为500 mL，即5倍柱体积。

2.2.5 吸附树脂重复使用次数确定

吸附树脂具有可再生、可重复使用的特点，但分离纯化样品之后，吸附树脂会吸附部分杂质，降低了自身的分离效果，一般情况下吸附树脂在分离纯化3～4 次后回收率降低至60%以下，需要活化再生后才能再次使用[29]。AB-8吸附树脂在重复使用3 次时，黄酮回收率为52.08%，低于60%的预设下限（P＜0.05）（图8）。因此，确定同一根吸附树脂重复使用2次后需再生活化。

图8 不同重复使用次数条件下黄酮的回收率Fig.8 Recoveries of flavonoids after repeated uses of AB-8

3 结 论

通过对AB-8、D-101、NKA-9和NKA-Ⅱ 4 种吸附树脂对蛹虫草黄酮的静态吸附、静态解吸和静态吸附动力学等特性的研究，发现AB-8吸附树脂对蛹虫草黄酮有较高的吸附速率和单位吸附量，且易于解吸，是蛹虫草黄酮分离的理想树脂。

确定AB-8吸附树脂对蛹虫草黄酮分离纯化的最优工艺条件：树脂装柱体积为100 mL时，最佳上样体积40.0 mL、黄酮上样量47.536 mg、淋洗和洗脱速率2 BV/h、淋洗液pH 5、洗脱液乙醇体积分数和体积分别为85%和500 mL，树脂重复使用次数为2次。在此条件下，蛹虫草黄酮的回收率在65%以上，纯度在17%以上，具有良好的分离纯化效果。

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