青蒿素合成生物学及代谢工程研究进展

曾庆平，鲍飞

（1.国家中医药管理局原虫与病毒重点实验室，广州 510405；2.广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405）

青蒿素合成生物学及代谢工程研究进展

曾庆平1，2，鲍飞1，2

（1.国家中医药管理局原虫与病毒重点实验室，广州 510405；2.广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405）

青蒿素（artemisinin）是中国科学家于20世纪70年代从传统中草药青蒿或称黄花蒿（Artemisia annua L.）中分离提纯的抗疟有效单体，其化学本质是含有“过氧桥”结构（1,2,4-三噁烷环）的倍半萜内酯[1]。以青蒿素为母核经人工半合成获得的青蒿素琥珀酸酯（青蒿琥酯）、青蒿素甲醚（蒿甲醚）、青蒿素乙醚（蒿乙醚）和双氢青蒿素等青蒿素类药物，血中溶解性好，生物利用度高，对氯喹抗性疟疾及致命性脑型疟有特效，已成为世界卫生组织（WHO）倡导的“基于青蒿素的联合疗法”（artemisinin-based combination therapies，ACTs）首选的抗疟新药，其中青蒿琥酯、蒿甲醚及蒿甲醚复方已被列入WHO“基本药品目录”[2]。

青蒿分布地域狭窄，青蒿素含量低（0.01%～0.5%）。化学合成青蒿素产率不理想，成本高。随着全球疟疾发病率（3.8亿人/年）和死亡率（4600万人/年）逐年升高[3]，青蒿素类抗疟药需求量迅猛增长，导致青蒿素原料药供不应求，市场价格飙升[4]。近10年来，为了从根本上解决青蒿素的供需矛盾，国内外争相开展了青蒿素合成生物学及代谢工程研究，一方面尝试在微生物体内重建青蒿素生物合成途径[5]，另一方面对青蒿中原有的青蒿素生物合成途径进行遗传改良[6]。

在Bill & Melinda Gates基金赞助下，由One World Health 非赢利组织主导，在Amyris Biotechnologies公司和Sanofi-Aventis公司参与下，美国加州大学伯克利分校Keasling研究小组会同加拿大植物生物技术研究所Covello研究小组，于2004年启动了以高产青蒿素酵母工程菌构建为目标的“青蒿素项目”（The Artemisinin Project）。该项目实施至今已获得产青蒿酸及双氢青蒿酸等青蒿素前体的基因工程酵母菌[7]。

可是，迄今仍无法将基因修饰酵母菌所产青蒿素前体转变成青蒿素，表明在青蒿中开展转基因研究仍然是一个不可忽略的重要方向，为此已育成青蒿素含量大幅提高的转基因青蒿植株或品系[8]。同时，英国约克大学的Bowles小组已绘制出青蒿的遗传图谱，并鉴定出青蒿素高产相关基因，为指导青蒿素高产育种提供了科学依据[9]。

如果说青蒿素合成生物学研究具有革命性和前瞻性，在未来可能取得突破性成果，那么青蒿转基因研究则更有现实意义，因为其成果是优良的青蒿种质。值得强调的是，中国科学家不仅在青蒿素合成生物学及代谢工程领域取得若干重大成果，而且正在引领着世界高产青蒿素转基因青蒿植株培育的新潮流，充分发扬了中国在青蒿素科学研究上的传统优势。本文拟对当前青蒿素合成生物学及代谢工程研究的最新进展进行初步评述。

1 青蒿素生物合成研究历史与现状

早在20世纪80年代，中国科学院上海有机化研究所汪猷院士领导的研究小组就利用放射性同位素标记的2-14C-青蒿酸与青蒿匀浆（无细胞系统）保温法证明，青蒿酸和青蒿素B是青蒿素的共同前体[10]。该结论相继得到放射性标记青蒿酸饲喂实验[11]、青蒿素B离体转化实验[12]和青蒿酸、青蒿素B、双氢青蒿素B离体转化实验[13]的支持。当然，也有不支持青蒿酸是青蒿素前体结论的实验结果[14]。香港大学施丽琼小组用15-[2H313C]-青蒿酸饲喂青蒿植株后发现，青蒿酸的代谢产物中仅能检测到11,13-脱氢倍半萜类（如青蒿酸、青蒿素B/脱氧青蒿素B、青蒿内酯/异青蒿内酯、杜松烷等），而未检测到11,13-二氢倍半萜类（如双氢青蒿酸、双氢青蒿酸氢过氧化物、青蒿素等）[15]。因此，有人认为，目前还不能完全排除其他中间产物作为青蒿素直接或间接前体的可能性。这些化合物包括： 青蒿酸、青蒿素B和青蒿烯、表-脱氧青蒿素B和二氢-表-青蒿素B、seco-杜松烷和青蒿烯[16]。

然而，荷兰瓦格林根大学的Quax小组从青蒿中分离出双氢青蒿酸及双氢青蒿酸氢过氧化物，并提出双氢青蒿酸经双氢青蒿酸氢过氧化物生成青蒿素的新观点[17,18]。巧合的是，韩国科学家发现，双氢青蒿酸与青蒿酸之间不能互变[19]，意味着青蒿中可能同时存在青蒿酸合成途径和双氢青蒿酸合成途径，ΔC11,13位的氧化还原状态是生成青蒿酸还是双氢青蒿酸的“分水岭”。换句话说，若产生青蒿酸，则不能继续转变成青蒿素；若产生双氢青蒿酸，则能最终获得青蒿素。这个结论正好与Bouwmeester小组发现青蒿中存在着青蒿素化学型和青蒿酸化学型的结果一致[20]。他们的研究结果还显示，青蒿中青蒿素的含量通常比双氢青蒿酸的含量低5～10倍，最大相差15倍[21]。因此，双氢青蒿酸向青蒿素的转变很可能是青蒿素合成的“瓶颈”，此过程涉及双氢青蒿酸氢过氧化物生成的限速反应。

若以双氢青蒿酸为青蒿素的直接前体，则青蒿素生物合成可以人为地划分成3个阶段：第一阶段是从乙酰辅酶A 经异戊烯基焦磷酸（IPP）、二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）、法呢基焦磷酸到紫穗槐-4,11-二烯的合成途径，其中DMAPP与IPP受IPP异构酶（IPPI）催化发生互变，二者再被法呢基焦磷酸合成酶（FDS）作用生成法呢基焦磷酸，并在紫穗槐二烯合酶（ADS）催化下闭环产生紫穗槐-4,11-二烯；第二阶段是从紫穗槐-4,11-二烯到双氢青蒿酸的合成途径，紫穗槐-4,11-二烯在细胞色素P450单加氧酶（CYP71AV1）催化下，经连续氧化依次生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，其中青蒿醛受青蒿醛双键还原酶2（DBR2）催化而还原成双氢青蒿醛，后者再在青蒿醛脱氢酶1（ALDH1）催化下氧化成双氢青蒿酸。双氢青蒿醇转变成双氢青蒿醛由ALDH1/CYP71AV1催化，其逆反应则由双氢青蒿酸还原酶1（RED1）催化；第三阶段是从双氢青蒿酸到青蒿素的合成途径，双氢青蒿酸经过未知的多个非酶促反应最终生成青蒿素。此外，青蒿酸可能经多步反应合成青蒿素B后再转变成青蒿素。图1为最新提出的青蒿素生物合成途径[22]。

2 青蒿素前体合成工程菌的构建

从萜类合成的角度，可以将青蒿素生物合成分为从乙酰辅酶A到法呢基焦磷酸的“上游”途径、从法呢基焦磷酸到双氢青蒿酸的“中游”途径和从双氢青蒿酸到青蒿素的“下游”途径。青蒿及其他高等植物与酵母等真核微生物合成法呢基焦磷酸的酶促反应完全相同（循甲羟戊酸途径），因而只需在酵母中额外增加一个青蒿素合成代谢支路，就能让酵母全合成青蒿素。目前，中游途径的酶促反应已通过导入青蒿ADS，CYP71AV1，CPR，DBR2和ALDH1等基因至酵母而得以完全重建，但下游途径的反应条件在酵母中则尚未建立。

回溯到2003年，美国Keasling小组将青蒿ADS基因经密码子优化后导入大肠杆菌中表达，同时用酵母萜类合成途径代替大肠杆菌萜类合成途径，首次在细菌体内合成出青蒿素的第一个关键前体——紫穗槐-4,11-二烯，在6 L发酵罐中培养60 h的产率实线箭头表示已被证实的反应步骤，虚线箭头表示推测或未被证实的反应步骤；粗线箭头表示主要反应步骤，细线箭头表示次要反应步骤；单箭头表示一个反应步骤，多箭头表示多个反应步骤达到450 mg/L[23]。2006年，他们将ADS基因连同CYP71AV1和CPR基因同时导入酿酒酵母中表达，培育出世界上第一株生产青蒿酸的酵母工程菌，经代谢途径修饰与优化，其产率已达153 mg/L[24]。加拿大Covello小组于2008年将新克隆的青蒿DBR2基因连同ADS，CYP71AV1 和CPR基因一同导入酿酒酵母，率先培育出合成双氢青蒿酸的酵母工程菌，其中双氢青蒿酸产率为15.7 mg/L，青蒿酸产率为11.8 mg/L[25]。中国医学科学院及北京协和医科大学药物研究所的程克棣小组将青蒿ADS基因按酵母偏爱密码子优化并导入酿酒酵母后，也培育出产紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌[26]。瑞典卡尔马大学的Brodelius小组将ADS基因导入酵母中，分别获得质粒表达及染色体整合表达的产紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌，其中质粒表达酵母工程菌培养16 d后的紫穗槐-4,11-二烯产量为0.6 mg/L[27]。

然而，到目前为止，国内外还没有一个研究小组将酵母工程菌中的青蒿素前体转变成青蒿素，其原因可能是酵母不具备青蒿素合成所需要的细胞环境。Covello小组的研究显示，在青蒿叶片表面具有特殊腺体结构并充满挥发性芳香油的腺毛（glandular trichome）细胞中，青蒿素合成酶基因高表达，暗示青蒿素生物合成可能就发生在腺毛细胞中[28]。香港大学施丽琼小组给青蒿饲喂标记双氢青蒿酸后并未测得标记青蒿素，推测腺毛油相环境缺乏可能影响了分子中羟基的稳定性[29]。在无腺毛隔离的环境中，青蒿素分子中特有的过氧化基团可能烷化蛋白质而检测不到青蒿素。作为佐证，我们发现青蒿素可与肿瘤细胞或细菌的一氧化氮合酶及过氧化氢酶的血红素辅基结合而使酶失活，导致一氧化氮水平降低，过氧化氢水平升高[30,31]。

这里面临着一个策略选择，即在微生物中合成青蒿素前体后是改用化学方法半合成青蒿素，还是继续探索让微生物将青蒿素前体转变成青蒿素的方法？现在看来，国外选择的是前者，并且已先期启动产业化进程。不过，从工艺、成本、环境影响等方面考虑，实现青蒿素的微生物全合成无疑有着更大的应用价值。

3 高产青蒿素转基因青蒿植株的培育

3.1 寻找高产青蒿素转基因青蒿培育的有效途径

青蒿素是一种次生代谢产物，它在青蒿中的积累量很小，而且不同地区生态类型的差异很大。中国科学院植物研究所叶和春研究小组最早开展转基因青蒿研究，他们将重组法呢基焦磷酸合成酶基因（FPS）导入青蒿，以增加FPS基因的拷贝数目，期望增大青蒿素生物合成途径的碳流（“开源法”），由此获得青蒿素含量比对照高3～4倍的转基因青蒿发根（0.2%～0.3%）[32]及比对照高2～3倍的转基因青蒿植株（0.8%～1%）[33,34]。类似地，印度科学家用重组羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（HMGR）培育转基因青蒿植株，其青蒿素含量提高22.5%[35]。

本课题组将反义鲨烯合酶基因（asSS）导入青蒿，以阻断竞争青蒿素生物合成的类固醇分支途径（“节流法”），获得类固醇含量比对照（0.08%鲜重）下降近一半（0.04%～0.05%鲜重）及青蒿素含量比对照（0.45%干重）提高近3倍（1.23%干重）的转基因青蒿植株[36]。上海交通大学唐克轩小组利用发夹RNA介导的RNA干扰技术阻断类固醇合成途径，使转基因青蒿中的青蒿素含量达到3.14%干重，比对照提高3.14倍[37]。最近，中国科学院植物研究所的研究小组利用β-石竹烯合酶cDNA反义片段抑制青蒿的倍半萜合成支路，通过减少β-石竹烯对紫穗槐-4,11-二烯的竞争，使青蒿素含量提高50%以上[38]。

在今后的研究中，可以考虑将“开源”与“节流”两种方法结合起来，也许能收到更好的效果。一种更有前景的创意是将青蒿中更多的非青蒿素合成途径剔除或者仅保留青蒿素合成途径及其他必要的代谢途径，从而通过合成生物学创造出自然界不存在的新型代谢网络。

3.2 通过调节激素及发育基因表达促进青蒿素合成

细胞分裂素可刺激叶片生长，而青蒿素主要由青蒿叶片合成。因此，提高青蒿中的细胞分裂素水平有可能促进青蒿素的合成。叶和春小组曾将异戊烯基转移酶基因（ipt）导入青蒿，结果使细胞分裂素水平提高2～3倍，青蒿素含量增加30%～70%[39]。有关植物激素与青蒿素合成的相关性及其作用机理详见后述。

为了阐明青蒿生长发育（尤其是生殖发育）与青蒿素高产的关系，叶和春小组曾用拟南芥开花促进因子1基因（fpf1）及成花基因（CO）分别转化青蒿，结果发现，虽然青蒿开花时间大大提前（分别提前20和14 d），但青蒿素含量并无明显提高，表明开花并非青蒿素高产的先决条件[40,41]。

3.3 利用异种植物创建青蒿素生物合成新支路

美国肯塔基大学的Chapel小组将青蒿ADS基因及鸟类FPS基因导入烟草中表达，经叶绿体信号序列引导，ADS和FPS被转运至叶绿体，并合成紫穗槐-4,11-二烯，产量达到25 μg/g鲜重[42]。如果将来能将青蒿素合成途径“搬到”叶绿体内，那么这种独特的“叶绿体催化”方法可能比常规的“细胞质催化”方法更能获得高产青蒿素。

荷兰Bouwmeester小组利用烟草表达青蒿ADS，FPS和HMGR 基因，获得产紫穗槐-4,11-二烯的转基因烟草。但是，当继续导入CYP71AV1基因后，却未检测到预期产物青蒿酸，而只检测到青蒿酸-12-β-双葡萄糖苷，产量达到39.5 mg/kg鲜重，推测其为烟草葡萄糖基转移酶的催化产物[43]。加拿大Covello小组将青蒿ADS和CYP71AV1基因导入烟草后，只检出紫穗槐-4,11-二烯和青蒿醇，未检出青蒿酸。若再导入DBR2和ALDH1基因，也只检出双氢青蒿醇，未检出双氢青蒿酸[44]。由此可见，尽管在青蒿以外的植物中重建青蒿素合成途径是可行的，但在产物（如青蒿酸糖苷）的后处理上可能会面临较多的技术困难。

3.4 通过细胞培养探索青蒿素的工厂化生产

长期以来，以美国堪萨斯大学Weathers研究团队为代表，系统地开展了青蒿茎尖及根系体外培养，并通过添加植物激素[45]、营养成分[46]、光照[47,48]、非生物胁迫刺激剂[49,50]等试图提高青蒿培养细胞的青蒿素含量，但结果均不理想。例如，在青蒿发根培养基中添加壳多糖能使其青蒿素含量提高6倍，但青蒿素的净产出仅为1.8 mg/g干重[51]，这说明开展青蒿细胞培养并非获取高产青蒿素的最佳选择。

4 关于青蒿素生物合成的几个关键问题

4.1 青蒿素合成基因表达具有时空特异性

我们利用实时荧光定量PCR技术追踪分析了青蒿素合成基因的发育及组织表达模式，结果显示，各基因的表达水平在8月份开花前达到高峰，其中青蒿素特异合成ADS mRNA和CYP71AV1 mRNA升幅最大，为最低水平的12和15倍。处于盛花期的青蒿在根、茎、叶、花各个组织中都能检测到青蒿素合成基因的表达，叶片中ADS mRNA 水平较其他组织高2倍左右[52]。我们采用组织化学染色法和分光光度法对CYP71AV1启动子-GUS融合基因转化烟草在正常和胁迫条件下的表达进行定性及定量检测，结果表明，在脱水、4℃和紫外辐射条件下，转基因烟草的GUS 活性提高1.4～2.7倍[53]。瑞典及荷兰科学家的研究结果表明，ADS，CYP71AV1，DBR2和ALDH1等青蒿素合成基因在花芽及嫩叶中的表达水平比其他组织（老叶、茎、根、发根培养细胞）高40～500倍，而对青蒿素合成有负调节作用的双氢青蒿醛还原酶基因（RED1）则只在发根培养细胞中高表达[54,55]。

4.2 内外环境因素促进青蒿素的合成与积累

早在2000年，叶和春小组就证明，植物病原真菌可以不同程度地促进体外培养青蒿发根中青蒿素的积累，其中大丽花轮枝孢处理发根后的青蒿素含量比对照提高45%[56]。南京大学谭仁祥小组也证实，来自真菌的寡聚糖激发子可使青蒿素含量从7 mg/g干重提高到13 mg/g干重，而寡聚糖激发子与一氧化氮供体硝普钠共用，则青蒿素含量升高至12～22 mg/g干重[57]。

叶和春小组还发现，外源性赤霉酸可以通过反馈抑制赤霉酸合成，将碳源分流到青蒿素合成途径，导致青蒿素含量增高，同时青蒿酸含量降低，表明从青蒿酸到青蒿素是青蒿素合成的限速步骤之一[58]。美国Weathers小组的研究发现，在青蒿发根培养基中添加2-异丙基腺嘌呤（一种细胞分裂素），也能显著提高青蒿素含量[59]。

比利时根特大学及加拿大Covello小组的最新合作研究结果表明，茉莉酸既能加速腺毛发育，也能上调倍半萜合成基因表达，并大幅提高倍半萜含量[60]。香港中文大学的研究人员发现，茉莉酸甲酯对青蒿素合成的影响取决于青蒿的化学型，其中Ⅰ型积累较多的双氢青蒿酸和青蒿素，而Ⅱ型中青蒿酸和青蒿素显著减少[61]。

中国科学院植物研究所的研究团队也发现，水杨酸可使青蒿素、青蒿酸和双氢青蒿酸含量分别提高54%，127%和72%[62]。意大利科学家证实，50 mmol/L β-环糊精或50 mmol/L β-环糊精+水杨酸可使青蒿悬浮培养细胞中的青蒿素含量达到27 μmol/g干重，比对照高300倍左右[63]。他们还发现，22 μmol/L水杨酸可在30 min内诱导青蒿素含量升高3倍，而200 μmol/L咪康唑则在24 h内使青蒿素含量提高2.5倍[64]。

4.3 青蒿素产量与单线态氧水平高度相关

以往研究表明，青蒿收获后干燥[65]及重金属（铅）、盐胁迫[66]处理青蒿均有利于青蒿素的积累，推测极端环境胁迫尤其是氧化胁迫可能与青蒿素合成有着十分密切的关系，但始终缺乏活性氧参与青蒿素生物合成的证据。

我们研究发现，转基因青蒿植株经过冷处理后，单线态氧的释放比对照植株明显增强，同时青蒿素含量从1.23%增加到1.66%，转基因青蒿植株干粉经15个月贮存后青蒿素含量升至2.35%[67]。我们采用mRNA定量扩增技术系统地研究了低温[68]、衰老[69]、水杨酸及茉莉酸甲酯[70]等内外环境因素对青蒿素生物合成的影响，结果发现青蒿素合成mRNA水平升高、酶类合成增加、青蒿素含量提高均与单线态氧大量释放同步发生，从而为单线态氧参与调节青蒿素生物合成提供了直接证据。

4.4 单线态氧来自青蒿叶绿体并可诱导青蒿素合成基因表达

拟南芥的条件性flu突变体在由黑暗转光照的交替中可激发叶绿体产生单线态氧[71]，并且由核基因组编码的叶绿体蛋白Executer 1 和Executer 2负责单线态氧信号从叶绿体向细胞核的逆向转导[72]。最近，我们还发现，Executer 1基因与抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶）基因均受萜类合成抑制剂处理后激发的单线态氧的共调控（未发表结果）。

关于内源性与外源性单线态氧在青蒿素合成中的作用，我们利用类胡萝卜素合成抑制剂证明，叶绿体释放的单线态氧可作为“逆向信号转导分子”诱导核内编码的青蒿素合成相关基因表达[73]。相反，我们在培养基中添加单线态氧光敏发生剂孟加拉玫红（rose Bengal）并照光或通入次氯酸钠与过氧化氢反应产生单线态氧后，不仅显著降低青蒿素含量，而且导致大量未知产物合成[70]。

以上结果表明，单线态氧催化的非酶促反应可能是青蒿素生物合成的限速步骤，而单线态氧来源于细胞内而不是细胞外，内源性单线态氧不仅能上调青蒿素合成基因表达，而且可催化双氢青蒿酸转变成青蒿素。

5 结论及展望

近10年来，青蒿素合成生物学进展速度惊人，通过微生物发酵生产青蒿素前体已接近工业化规模，但目前还不能实现青蒿素在微生物体内的全合成。国外拟采取“两步法”策略半合成青蒿素：第一步是在微生物中获得青蒿素前体，第二步是利用化学方法将青蒿素前体转变成青蒿素。该方法一旦实施成功并实现产业化，必将带来青蒿素生产方式的彻底变革，也是缓解日益严重的青蒿素短缺局面的根本出路。

青蒿素合成基因基本上都由国外研究机构首先发现并鉴定，而且几乎所有相关基因均已申请国际专利保护，我国培育青蒿素前体合成微生物工程菌将面临诸多的专利壁垒。因此，我国不宜步国外研究后尘开展产青蒿素前体工程菌构建的跟风研究，而应该一方面着力推动具有自主知识产权的高产青蒿素转基因青蒿的田间试验和评价，另一方面加强青蒿素合成终端反应的分子机理研究，并在此基础上建立青蒿及转基因青蒿中由双氢青蒿酸高效转变为青蒿素的外部条件，争取早日实现高产、优质、多抗等优良农艺性状的转基因青蒿品系的推广应用。

摘编自《科学通报》2011年56卷27期：2289～2297页，图、表、参考文献已省略。