Laennec组织病理学分级与HYP含量、临床分期及肝功能的关系

王薇，李继业，潘润华，阿斯楞，廖彩仙

2.3 Laennec组织病理学分级与HYP含量的关系

肝硬化是一种或几种致病因子长期反复作用于肝脏引起的慢性进行性弥漫性肝损害，是肝脏病变的终末阶段。胶原是细胞外基质（ECM）的主要蛋白质成分，约占机体总蛋白的25%左右，肝脏中胶原含量丰富，对肝细胞的分化、肝小叶结构与功能的维持等有着重要的影响。肝硬化存在着以胶原为主的ECM增生沉积，其主要病理表现为肝细胞弥漫性坏死、纤维增生，并形成再生结节和假小叶，导致肝脏结构不可逆改变。其胶原蛋白含量增加为正常肝组织的3～5倍[1]。羟脯氨酸（HYP）是肝脏胶原蛋白所特有的氨基酸，因此测定羟脯氨酸含量，可明确胶原总体水平，是分析组织胶原水平的标准方法，可客观反映肝脏硬化程度[2]。

随着胶原蛋白的沉积，肝硬化不断进展，门脉压力增高，肝硬化的并发症（食管胃底静脉曲张、腹水、肝性脑病等）随之而来。根据有无并发症的发生，临床中将肝硬化分为代偿期和失代偿期两个阶段[3-5]。因此，肝硬化的严重程度存在一个明显的组织病理学变化。随着更加细化的临床分期的出现，以及抗纤维化药物的发展，更加细致的肝硬化组织病理学分期将更加必要[6]。Laennec组织病理学分级系统根据组织病理学纤维间隔及厚度的半定量方法，将肝硬化（4期）进一步分为4A、4B、4C三个阶段，更好地区分了不同严重程度的肝硬化。

本研究收集了2013年7月至2014年6月期间我院收治的肝炎后肝硬化患者30例，研究其Laennec组织分级与临床分期、HYP含量及肝功能的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

本研究纳入了2013年7月至2014年6月期间我科收治的肝炎后肝硬化患者，所有患者均经肝活检证实为肝硬化，血清学诊断HBV（+），经CT、超声检查未发现明显占位，AFP（-），排除酒精性肝硬化、自身免疫性肝硬化、胆汁淤积性肝硬化等其他因素，除外严重肝功能衰竭（胆红素＞85μmol/L或肝性脑病）、肝肾综合征、可能存在心血管疾病、非肝硬化门脉高压或使用其他任何药物治疗及预防食管静脉曲张破裂出血的患者。30例患者中男24例，女6例，年龄29～64岁，平均48.33岁。

纳入的患者均行胃镜检查，明确有无胃底食管静脉曲张；行增强CT、肝胆超声检查，根据辅助检查及术中探查情况，确定患者腹水情况；详细询问病史，确定有无消化道出血史；以及血清生化检查；从而确定患者的临床分期、Child-Pugh评分、MELD评分。患者一般基本情况见表1。

1.2 组织活检及病理分级

术中取大小约为10 mm×10 mm肝组织，留取10 mm×5 mm肝组织放入-80 ℃冰箱冻存备用，其余组织进行石蜡包埋，HE染色，在对患者基本情况未知的情况下，由2人根据间隔厚度及数量根据进行Laennec组织病理学分级。根据Laennec组织病理学分级标准（表2），将肝组织分为7个等级：0级，无纤维化；1级，极少纤维化（无间隔或极少细小间隔，可有汇管区扩大或轻度窦周纤维化）；2级，轻度纤维化（偶有细隔）；3级，中度纤维化（中等度细隔，不完全纤维化）；4A级，可能或肯定的轻度肝硬化；4B级，中度肝硬化（至少两个宽间隔）；4C级，重度肝硬化（至少一个很宽的间隔或许多小结节）（表2）。

1.3 胶原蛋白含量的测定

将肝组织标本干燥至恒重，并精确称取重量，加入一定量PBS（pH7.4），用均浆器仔细将标本均浆充分，离心20 min（3000 r/min）。仔细收集上清。采用双抗体夹心法测定标本中人羟脯氨酸（HYP）水平。用纯化的HYP抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中一次加入HYP再与辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的HYP抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的HYP含量成正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中HYP的浓度。胶原蛋白含量与HYP含量成正相关，测定肝组织中羟脯氨酸水平。因HYP是肝脏胶原蛋白所特有的氨基酸，固HYP水平可以直接反映肝脏组织内胶原蛋白含量，较为客观反映肝脏硬化程度。

表1 一般资料信息

表2Laennec肝穿刺组织纤维化分级评分系统

1.4 临床分期

目前临床上根据有无主要并发症（食管胃底静脉曲张破裂出血、腹水、肝性脑病等），将肝硬化简单的分为代偿期与失代偿期，为了更准确地预测肝硬化患者的生存情况，本研究将肝硬化分为4期[5，7]。1期：无静脉曲张、腹水；2期：有静脉曲张，无消化道出血及腹水；3期：有腹水，无消化道出血，有或无静脉曲张；4期，有消化道出血，可有或无腹水。其中1期、2期对应肝硬化代偿期，3期、4期对应肝硬化失代偿期。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件，Laennec病理分级与临床分期和MELD评分及肝硬化程度的相关性采用Spearman秩相关和x2检验或Fisher检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Laennec组织病理学分级与临床分期的关系

Laennec 组织病理分级与临床分期具有显著的相关性（r=0.58，P＜0.01）。无消化道出血史的患者病理分级为4A级占总数的57.1%，有消化道出血史的患者组织病理分级为4A级的仅为8.7%（P=0.016）。各临床分期中组织病理分期为4A为1期100%，2期66.7%，3期33.3%，4期4.5%。全部组织病理分级为4C的患者均为肝硬化失代偿期即临床分期为3、4期。具体见表3、图1。

表3 Laennec组织病理分级与临床分期的关系

图1 Laennec病理分级与临床分期的关系

2.2 Laennec组织病理学分级与MELD评分以及Child-Pugh评分的关系

MELD评分与Laennec组织病理学分级存在明显的相关性（r=0.60，P＜0.01）。4A、4B、4C所对应的MELD评分分别为（9.00±1.79），（9.36±1.50），（12.46±3.43）（P＜0.01）。随着MELD评分的增加，Laennec组织病理学分级的等级也就越高（图2）。对于Child-Pugh评分，由于本实验纳入的病例缺少C级评分，故未能得出相应的结论，还需进一步大范围的研究。

2.3 Laennec组织病理学分级与HYP含量的关系

Laennec组织病理学分级与HYP具有显著的相关性（r=0.53，P＜0.01）。随着Laennec分级的增高，HYP含量升高，胶原蛋白含量增加，肝脏硬化程度加重。Laennec病理分级为4A级的HYP含量为（0.31±0.10）μg/g，4B级HYP含量为（0.51±0.41）μg/g，4C级HYP含量为（1.86±1.31）μg/g（P＜0.01）。见图3。

图2Laennec病理分级与MELD评分的关系

图3Laennec病理分级与HYP含量的关系

3 讨论

目前，关于肝纤维化的许多组织病理学分级均将肝硬化视为一个病理阶段，而临床工作中将肝硬化至少分为代偿期及失代偿期2个临床阶段，这种组织病理学定义的肝硬化与临床实践中的不同步，不利于肝硬化患者病情变化的观察，将给临床与科学研究带来不少问题，特别是无法较为准确的评价抗肝纤维化治疗的效果。例如经抗纤维化治疗后，有望将Laennec组织病理学分级为4C的患者改善为4A，但如果按照传统的病理分级，这种改善将被忽略，导致得出抗纤维化治疗无效的错误结论。最新研究认为，如果去除诱因，肝硬化存在可逆潜能。许多研究表明，在有效的抗病毒治疗下，可减少肝炎后肝硬化的纤维化程度和炎症活动度[6，8-11]，所以将肝硬化病理亚分类是及其有必要的。本研究首次将肝硬化组织病理学分类与肝功能指标相关参数及HYP的关系进行阐述。

随着肝硬化的进展，肝脏中胶原蛋白含量增加，正常肝细胞由纤维结缔组织替代，肝脏正常结构被破坏，将增加肝内血管阻力，增加门脉压力，从而出现静脉曲张、腹水等并发症[3]。门静脉压力逐渐增高是肝硬化患者病程进展的标准，并导致其并发症的发生及死亡率的增高。有研究证实组织学间隔厚度与门脉压力密切相关[12-13]，Laennec组织病理学分级就是以此为依据将肝硬化分为4A、4B、4C三个等级。2005年Baveno IV共识建议将肝硬化根据其有无静脉曲张、腹水及食管静脉曲张破裂出血分为4个临床阶段[10]。临床1期、2期对应无症状期，即肝硬化代偿期；临床3期、4期对应进展期，即肝硬化失代偿期。这样的分类主要依据门静脉高压的临床表现。

在本组研究中，失代偿期患者的肝脏组织病理学分级更趋向于高的等级，而代偿期患者的组织病理学分级则更趋向于较低的等级。研究表明，肝硬化组织病理学分级与胶原蛋白含量成正相关，且食管胃底静脉曲张破裂出血的风险随着病理分级增高而增加。MELD评分是目前临床广泛应用的评价肝功能的指标之一，Laennec组织病理学分级与MELD评分具有很好的相关性，本研究虽未能得出Laennec组织病理学分级与Child-Pugh评分的关系，但其他学者的既往研究已证明，Laennec组织病理学分级与Child-Pugh评分具有良好的相关性[21]。Laennec组织病理学分级系统可以一定程度的反映肝脏硬化程度、临床阶段以及肝功能情况，因此，我们建议使用Laennec组织病理学分级更加细致的将肝硬化分级，以便临床实践及科学研究。肝活检术虽然是肝硬化组织病理学评估的金标准，但仍存在一定的不足，例如采样的随机误差及肝活检带来的并发症等。随着现代科技的进步，一些采用无创的方式测定肝纤维化的技术[14-15]，如瞬时弹性成像技术、声脉冲辐射力成像技术、磁共振弹性成像技术[22]在飞速进步。这些无创技术对于判断有无肝纤维化和肝硬化有很大价值，却难以精确区分相邻两级的肝纤维化。肝活检仍然将在一段时间内广泛应用于临床实践中，本研究的临床意义仍不能被忽视。应用Laennec组织病理学分级的肝脏组织病理学评价与HYP含量、临床分期以及MELD评分均有显著的相关性，这表明，组织病理学亚分类对肝硬化患者的诊断及预后判断均可提供有力的证据。我们还将进一步扩大纳入患者的数量，并对患者进一步长期的随访，了解患者并发症的发生情况及生存情况。

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