乳制品中马尿酸HPLC的测定

郭文丽，汪晓冬，廖振宇，艾玉，曹东丽

（天津市产品质量监督检测技术研究院，天津300384）

GB2760-2011《食品添加剂使用标准》规定，乳制品中不得使用苯甲酸等防腐剂用于生鲜乳保鲜[1]。在实际检测中，部分乳制品中能检出苯甲酸。研究表明乳制品中的苯甲酸会天然存在，其绝大部分是生产过程中原料乳中马尿酸脱去甘氨酸生成，并且这个反应是不可逆的[2]。马尿酸（Hippuric Acid，HA）又名苯甲酰氨基乙酸，是食植动物代谢的副产物，多存在于马和草食性动物的尿液中，也可通过乳汁排出，同时会存在于原料奶中[3]。因此，为了更好地研究乳制品中苯甲酸的来源，建立了能够同时测定乳制品中马尿酸和苯甲酸含量的HPLC 方法，该方法对控制、解决乳制品的安全卫生问题具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Agilent1260 series；美国Agilent公司）；色谱柱（Waters 柱，150 mm×4.6 mm，粒度2.7 μm）；离心机（H2050R；长沙湘仪离心机仪器有限公司）；恒温振荡器（HNY-100B；天津市欧诺仪器仪表有限公司）。

1.2 主要试剂

乙腈（HPLC 级，DikmaPure 公司）；甲醇（HPLC 级，DikmaPure 公司）；苯甲酸标准品（Dr.EhrenstorferGmbH）、马尿酸对照品；醋酸；磷酸二氢钾；KH2PO4；氢氧化钠；去离子水。

标准储备液：精密称取马尿酸和苯甲酸标准品各5 mg，于50 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配置成浓度各为100 μg/mL 标准储备液。

混合标准工作液：精密量取浓度为100 μg/mL 的马尿酸和苯甲酸标准储备液适量，用50%甲醇溶液定容，配置成浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、5 μg/mL 的系列混合标准溶液。

1.3 高效液相色谱参数的优选[2，4-5]

本实验采用单因素法，对HPLC 同时测定马尿酸、苯甲酸的主要参数——流动相、柱温、流速、进样量等进行优选。选用1 μg/mL 的马尿酸、苯甲酸混合标准溶液进行优选实验。

1.3.1 流动相种类的优选

分别用下列不同的流动相对1 μg/mL 的马尿酸、苯甲酸混合标准溶液进行测定。

（1）甲醇+0.4%醋酸溶液=35+65

（2）乙腈+0.4%醋酸溶液=35+65

（3）甲醇+0.05 mol/L 磷酸溶液=35+65

（4）乙腈+0.05 mol/L 磷酸溶液=35+65

（5）甲醇+0.02 mol/L KH2PO4溶液=35+65

（6）乙腈+0.02 mol/L KH2PO4溶液=35+65

1.3.2 流动相溶剂配比的优化

在确定流动相后，进一步优选流动相溶剂配比。分别以乙腈+0.4%醋酸溶液=15+85、25+75、35+65、45+55、55+45 为流动相，对1 μg/mL 混合标准溶液进行测定。

1.3.3 柱温的优选

在确定流动相配比后，分别设定柱温为25、30、35、40、45 ℃，以确定最适温度。

1.3.4 流速的优选

设定仪器流速0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL/min，检测混合标准溶液，根据目标物质的分离度、峰型等选择合适的流速。

1.3.5 进样量的优选

分别设定进样量为5、10、15、25、50μL，测定1μg/mL的混合标准溶液。

1.4 预处理条件

样品提取[6]。

在提取马尿酸和苯甲酸时，要去除牛奶中的大分子干扰物质如蛋白质、脂肪等。称取20 g 样品（精确至0.01 g）于100 mL 容量瓶中，加入25 mL0.1 mol/L 氢氧化钠溶液，混合后置于超声波水浴或70 ℃水浴中处理15 min。冷却后，用0.5 mol/L 硫酸溶液将pH 调节到8（用pH 计或pH 试纸均可），分别加入2 mL 92 g/L亚铁氰化钾溶液和183 g/L 乙酸锌溶液。剧烈振摇，静置15 min，混合后冷却到室温，再用甲醇定容，静置15 min，4 000 r/min 离心，上清液经过0.22 μm 滤膜过滤。收集滤液作为试样溶液，用于高效液相色谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1 检测条件的优化

实验结果表明，（2）流动相峰高较高、峰型相对较好、灵敏度较大；基于与杂质色谱峰的分离度、峰高、峰宽以及对称性等因素，其35+65 的相配是最优选择；35 ℃时，2种物质的色谱峰高而窄，对称性好；0.6 mL/min 时，2种目标物得到了很好的分离，且分析时间短；进样量为10 μL 时色谱峰对称性好，峰高高。

综上所述，本文选择的色谱条件为：流动相组成：A 通道为去离子水，B 通道为甲醇（色谱纯），C 通道为乙腈（色谱纯），D 通道为0.4%醋酸溶液（已抽滤）；柱温35 ℃；流速0.6 mL/min；进样量10 μL；检测波长235 nm。

2.2 线性方程

对浓度为0、0.1、0.2、0.5、1、5 μg/mL 的马尿酸、苯甲酸混合标准溶液进行检测，测定其相应的峰面积绘制标准曲线，得线性方程、相关系数：

Y=10.250 622 5×X-0.417 895 6 R=0.999 0（马）

Y=10.556 950 4×X+0.378 122 6 R=0.999 8（苯）

式中：Y 为面积；X 为含量。

图1 马尿酸、苯甲酸混合标准品谱图（1.0 μg/mL）Fig.1 Chromatogram of mixture HA and Benzoic Acid sample（1.0 μg/mL）

在图1中马尿酸（HA）的出峰时间为2.841，苯甲酸（BJS）的出峰时间为4.594。

2.3 检测灵敏度（方法测定低限）

根据国标GB/T27404-2008，方法的测定低限按下式计算：

式中：CL 为方法的测定低限；Sb 为空白值标准偏差（一般平行测定20 次得到）；b 为方法校准曲线的斜率。

在本实验中Sb=1.113 767，b=10.250 622 5，根据上式计算方法测定低限为0.326 mg/kg（马）；Sb=1.235 521，b=10.556 950 4，根据上式计算方法测定低限为0.351 mg/kg（苯）。

2.4 回收率实验

取牛奶样品，做空白对照。分别作0.5、5、10 mg/kg 3个水平、6 个平行添加回收率实验。样品按照前述实验步骤操作测定。结果如下表。

表1 牛奶苯甲酸、马尿酸的回收率Table1 Recoveries of Benzoic acid，HA in milk

2.5 精密度

分别取2 个水平，浓度为0.2、1 μg/mL 的马尿酸、苯甲酸标准溶液在本文选取的最佳参数下做平行，进样7 次，测定相应的峰面积。结果表明，本法的RSD（%）＜2%，具有良好的精密度，较高的重现性。且浓度较低时，相对偏差较大；浓度较大时，相对偏差较小。

表2 精密度试验结果Table2 The result of the precision experiment

2.6 实际样品测定

在HPLC 分析中，通过峰的保留时间将标准色谱峰与样品色谱峰对照、定性，同时可查看相应峰的吸收波长进行精确判断。然后利用标准曲线计算出待测样品中2种目标物质的含量。在市场流通领域选取多家品牌不同规格的产品，样品经前处理后进行检测。在对13种纯牛奶检测时发现1种样品含有马尿酸及其转化产物苯甲酸（见图2）。

图2 某纯牛奶样品检测谱图Fig.2 Chromatogram of milk sample

图2为该纯牛奶样品的检测谱图。根据公式计算得出该样品中马尿酸的含量为4.6 mg/kg，苯甲酸的含量为3.4 mg/kg。

3 结论

本文建立了同时测定乳制品中马尿酸、苯甲酸的HPLC 方法，本方法的相关系数分别为0.999 0 和0.999 8；检出限分别为0.326 mg/kg 和0.351 mg/kg；方法的RSD（%）（n=7）＜2%，说明该方法具有良好的准确度、精密度和较高的重现性，适用于乳与乳制品中马尿酸和苯甲酸的残留分析。通过本实验提供的方法可以方便、可靠地分析乳制品中苯甲酸的本底水平，有助于科学、准确的综合判定。

[1] 中华人民共和国卫生部.GB 2760-2011 食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2011:352

[2] 谢国祥,吴丽莉,宋如森,等.乳制品中马尿酸的检测及其在发酵过程中动态变化研究[J].分析检验,2005(9):426-429

[3] 顾瑞霞.乳与乳制品的生理功能特性[M].北京:中国轻工业出版社,2000:213

[4] The International Dairy Federation.IDF 139 Milk,Dried Milk, Yogurt and Other Fermented Milks Determination of Benzoic and Sorbic Acid content[S].Belgium:IDF,1987

[5] 陈亚成,贾彩凤,王疆元,等.牛乳中苯甲酸的HPLC 测定及来源分析[J].食品工业科技,2010(6):94-95,99

[6] 中华人民共和国卫生部.GB 21703—2010 食品安全国家标准乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定[S].北京:中国标准出版社,2010:6