凋亡相关因子对脑卒中影响机制的研究进展

詹宇豪，沈俊明，王智惠，王亚飞 综述，张文丽 审校

凋亡相关因子对脑卒中影响机制的研究进展

詹宇豪1，沈俊明1，王智惠2，王亚飞1综述，张文丽2审校

脑卒中是一种以脑血液循环障碍为主要表现的疾病，在脑卒中的发病过程中，脑细胞凋亡相关因子的动态表达与调控是目前神经病学领域研究的重要方向。笔者查阅相关文献，综述了Caspases蛋白家族、Bcl-2蛋白家族、细胞色素C（cytochrome complex，cyt-c）、即早反应基因c-fos、p53基因、Fas基因对脑卒中的重要作用及影响机制。

凋亡相关因子；脑卒中；影响机制

1 Caspases蛋白家族

研究者们通过对线虫体细胞凋亡的研究，发现了哺乳动物中与线虫细胞凋亡关键基因ced-3、ced-4、ced-9

脑卒中，又称脑血管意外，是脑部出现出血性或缺血性损伤的临床表现，多发于中老年人，病情凶险，严重者可致意识障碍、痴呆、肢体瘫痪甚至死亡，该病也是高血压患者的主要致死原因。脑卒中发病后，缺血中心区神经元主要发生不可逆性死亡，而周围缺血半暗带区神经元损伤的主要形式为凋亡[1]。细胞凋亡是机体在生长、发育和受外界刺激时，清除衰老、损伤细胞以保持机体正常功能的一种自我调节机制。大量研相对应的同源基因Caspases、Apaf-1及Bcl-2。Caspases蛋白家族是一组半胱氨酸蛋白酶，在哺乳动物细胞凋亡过程中居于核心地位[4]。细胞中合成的Caspase以无活性的酶原状态存在，经细胞内、外两种途径激活后发生级联反应，特异水解多种胞浆底物，并将信号传入细胞核，引起其凋亡。其中，细胞外途径由隶属肿瘤坏死因子（tumor necrosis factors，TNF）/神经营养因子（nerve growth factor，NGF）受体亚家族的细胞表面死亡受体的配体启动，而细胞内途径与线粒体释放cyt-c有关。细胞凋亡包括Caspase依赖性和非Caspase依赖性两种途径；Caspases蛋白分为两类：一类是上游启动蛋白，如Caspases-8、9等，它们可以裂解并激活其他Caspases蛋白；另一类是下游效应蛋白，如Caspase-3、6、7，它们可以裂解底物蛋白，分解细胞结构或使酶失活；在Caspases蛋白家族中，Caspase-1、4、5主要在炎性反应中起作用，Caspase-2、3、8、9、10则与细胞凋亡密切相关；活化的Caspase蛋白可以使线粒体外膜的通透性改变，干扰电子在线粒体膜上的运输，导致膜电位变化，进而释放促凋亡因子[5,6]。其中被称为“刽子手”蛋白酶的Caspase-3，在凋亡过程中至关重要。

Caspase-3与线虫细胞凋亡所必需的ced-3基因同源性最高，是哺乳动物细胞凋亡的关键执行者。凋亡的早期阶段，活化的Caspase-3引起一系列级联反应，在两条凋亡途径中扮演下游效应分子的作用，一旦被激活，则引起下游级联反应，通过酶解灭活凋亡抑制物、酶解细胞外基质及骨架蛋白、裂解DNA修复相关分子等最终引起细胞凋亡[7]。故Caspase-3也被称为“凋亡蛋白酶”。作为多种凋亡刺激信号传导的交汇点，Caspase-3的活化可视为凋亡进入不可逆阶段的标志，也是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统。研究者们用大鼠建立了永久性大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，发现脑卒中大鼠脑组织Caspase-3表达增高，证明了Caspase-3的表达水平直接反映细胞凋亡情况[8]。Zhou L等[9]研究丹参酮IIA对短暂性局灶性脑缺血组织的神经保护作用，发现Caspase-3和Caspase-8的表达受到抑制，脑梗死面积明显减少。 刘杰等[10]采用大鼠自体血栓制作大脑中动脉梗死模型，研究超过溶栓时间窗的急性脑梗死溶栓治疗对大鼠脑组织Caspase-3表达的影响，发现6 h溶栓组比对照组表达明显减少，减轻了细胞凋亡。相反，脑卒中时接受不良刺激如吸烟引起脑缺血半暗带区Caspase-3表达及活性异常增加，则可加重脑缺血损伤诱导的细胞凋亡，具有加速神经细胞坏死的作用[11]。

2 Bcl-2蛋白家族

Bcl-2即B细胞淋巴瘤/白血病基因-2，自1984年首次从滤泡性B细胞淋巴瘤中分离以来，其抗凋亡作用逐渐成为研究热点。Bcl-2家族包含一组相关蛋白，根据其作用分两类：一类起抗凋亡作用，包括Bcl-2、Bcl-xl等；另一类起促凋亡作用，包括Bax、Bak、Bid等。其中Bcl-2、Bcl-xl、Bax家族各成员之间可以形成同源或异源二聚体，通过它们之间的相互作用，在细胞凋亡途径的上游远端构成了一个重要的细胞内凋亡调控点。目前研究证明，Bcl-2蛋白分布于内质网表面及核膜，线粒体外膜的浆膜面，可以稳定线粒体膜，防止线粒体释放Caspase、凋亡诱导因子和cyt-c等[12]；封闭Bax形成孔道的活性，从而抑制细胞的凋亡，Bcl-2/Bax的比值决定了脑卒中细胞是否进入凋亡程序。近年来，部分学者研究多种作用于Bcl-2蛋白家族的药物，通过改变其表达及比值，来阐述其在脑缺血治疗中的作用。宋先红等[13]观察发现脑通汤可作用于脑卒中后大鼠海马神经元，使得抑制凋亡基因Bcl-2增多、促进凋亡基因Bax表达减少，Bcl-2 / Bax比例明显增高，神经元凋亡减少，从而使海马神经血管单位得到整体改善，这也印证了Bcl-2蛋白家族在脑卒中的重要修复作用。Cho Y S等[14]采用沙土鼠脑缺血模型研究乌司他丁对缺血损伤器官的保护作用。结果显示在缺血的海马组织中，Bax表达增加，Bcl-2表达降低，而经过治疗后，Bcl-2/ Bax的比例发生了逆转，这明显改善了海马细胞凋亡情况，有效改善了脑缺血状态。以上均表明Bcl-2蛋白家族在脑缺血相关疾病的治疗中发挥着至关重要的作用。

3 cyt-c

cyt-c是线粒体呼吸链中传递电子的载体。在研究细胞凋亡时发现的DNA片段（即凋亡片段）依赖于某种细胞器碎片的存在，并在细胞胞浆中提取出3种成分，分别被称作凋亡蛋白激活因子1～3（apoptosis protease activating factor，Apaf 1～3），其中Apaf 2就是cyt-c[13]。cyt-c本身就能诱导细胞发生凋亡，也可与外源性cyt-c和ATP协同发挥作用而促使细胞凋亡。脑卒中缺血缺氧后，随着线粒体呼吸活性的丧失，cyt-c自线粒体内释放到细胞质，与Apaf-1结合形成寡聚体，进一步激活Caspase-9、Caspase-3，破坏细胞的基本结构和重要蛋白，导致凋亡小体产生。邢变枝等[15]发现大鼠脑缺血再灌注损伤后cyt-c表达增高，表明cyt-c进入细胞质是脑卒中细胞凋亡过程的关键步骤。刘庆杰等[16]观察乌司他丁对局灶性脑缺血-再灌注大鼠脑组织cyt-c及凋亡细胞数的影响，结果对照组和治疗组大鼠脑组织皮质区cyt-c的表达及凋亡细胞数均明显高于假手术组（P＜0.05），表明cyt-c表达降低，能减轻线粒体损伤，抑制线粒体通路的凋亡途径。Huang X P等[17]通过对小鼠双侧颈总动脉闭塞后进行再灌注，发现在缺血再灌注48 h后，神经细胞的存活率升高、凋亡率减低，其可能机制为降低cyt-c，caspase-3、9的表达，进一步抑制线粒体的凋亡途径。

4 即早反应基因c-fos

在原癌基因家族中，有一类能被第二信使所诱导的原癌基因，被称为“即刻早期基因”（immediately early genes，IEGs），又称快速反应基因。IEGs家族中具有代表性且研究较为深入的主要是c-fos和c-jun家族，其中以c-fos转录、激活最快，活性最高。正常情况下c-fos、c-jun在神经元中仅是低水平的表达，而在脑缺血等病理情况下却被快速地诱导高表达，其产物fos、jun通过亮氨酸拉链形成同源或异源二聚体复合物，该复合物调节后期反应基因的表达，间接参与对脑功能活动的信号转导和调控过程。c-fos表达产物（c-fos mRNA和c-fos蛋白）常作为细胞对缺血反应的敏感标志物，近年来其与脑外伤、癫痫、脑血管病等神经系统疾病的关系研究越来越多。Zheng W等[18]运用弥漫性脑损伤模型观察c-fos和c-jun表达的变化，结果显示脑损伤后1 h c-fos和c-jun表达即开始增加，其中c-fos在伤后3 h达到高峰，随后降低并于伤后3 d达到最高水平，伤后7 d明显降低较对照组仍维持在较高水平；c-jun阳性细胞在伤后6 h数量达到最多，随后减少并于伤后3 d达到最高水平，之后明显降低但与对照组相比仍维持在较高水平，说明c-fos和c-jun表达在脑损伤后随时间发生变化。毛晓霞等[19]以四血管阻断法建立全脑缺血再灌注损伤模型，发现药物干预降低c-fos与c-jun表达后，凋亡神经细胞明显减少。这些研究提示脑损伤后抑制c-fos与c-jun 基因的高表达，有利于减少脑卒中后神经元的凋亡。

5 p53基因

p53是肿瘤抑制基因，存在于细胞内的正常状态为野生型，其产物主要存在于细胞核内，是各种遗传毒性应激的感受因子，具有与单链或双链DNA结合的能力，与细胞分裂周期有关，对防止细胞增生和保持DNA受损基因组的完整性有重要作用，是脑卒中后的关键调控因子。脑缺血、缺氧等使脑细胞处于应激状态，DNA受损，p53介导下游基因表达，引起细胞凋亡[20]。研究表明，脑缺血后神经细胞凋亡同时伴有p53 基因表达上升[21,22]。改变Bcl-2/Bax比值，使cyt-c从线粒体转移至胞质继而引发Caspases家族级联反应可能是p53促凋亡的主要作用机制。颜玲等[23]发现抑制p53基因的表达，可明显改善脑缺血再灌注神经功能损伤和抑制神经元凋亡。Filichia E等[24]利用基因敲除技术使小鼠前脑神经元p53基因缺失，发现MCAO后，p53基因敲除小鼠脑梗死体积小且运动障碍程度更低。这些研究提示抑制p53基因表达则可抑制神经元凋亡，改善神经功能，减轻缺血性损伤。

6 Fas基因

Fas基因又称CD95或apo-l，属于TNF/NGF受体超家族成员，是外源性凋亡途径重要的促凋亡基因。Fas、Fas相应配体和Caspase-8的前体，共同组成死亡诱导信号复合体，可激活Caspase-8，类似凋亡复合体可引起Caspase级联反应，降解胞内结构蛋白和功能蛋白，诱导脑卒中细胞凋亡发生[25]。生理状态下Fas在免疫系统及肝、肾、心、肺、皮肤等组织有较高水平的表达，在大脑少量表达或不表达，但脑缺血可诱发Fas基因高表达。研究发现脑缺血缺氧损伤后的6～12 h Fas表达达到高峰，并且在受损伤的部位尤为明显，说明Fas在脑缺血缺氧后神经细胞的凋亡中起重要作用[26]。Fas表达障碍的MRL/lpr小鼠，对缺血缺氧性脑损伤具有耐受能力，局灶性脑缺血后的脑梗死体积较野生型小鼠显著缩小。实验表明，下调Fas及Fas配体的表达，脑梗死体积显著缩小[27,28]。这提示，Fas促进了脑缺血后神经细胞的凋亡过程，而抑制其表达则可从外源性凋亡途径抑制神经细胞凋亡继而对脑组织产生积极效应。

7 小 结

细胞凋亡是一个十分复杂的过程，包括多个通路，许多相关因子共同参与的信号转导，其病理过程，机制尚未完全清楚。目前国内外对于脑缺血损伤以及药物抗脑缺血的研究较多，深入研究凋亡相关因子的作用，探讨细胞凋亡机制，将为解决神经细胞凋亡这一主要矛盾提供新的靶点，进而更好地治疗脑卒中等脑缺血疾病，尚需同道们不懈努力。

[1]薛 茜, 邹玉安, 赵宝民, 等. 脑缺血再灌注半暗带细胞凋亡及Bcl-2/Bax比值的变化及中药干预机制[J]. 陕西中医, 2010, 31（7）: 926-930.

[2]Simões Pires E N, Frozza R L, Hoppe J B, et al. Berberinewas neuroprotective against an in vitro model of brain ischemia: Survival and apoptosis pathways involved [J]. Brain Res, 2014, 1557（15）: 26-33.

[3]樊鸿浩, 李茹冰. 脑缺血灌注损伤的相关细胞通路调节研究进展[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2015, 29（2）: 310-316.

[4]Dantas A E, Horta C C, Martins T M, et al. Whole venom of Loxosceles similis activates caspases-3,-6,-7,and-9 in human primary skin fibroblasts [J]. Toxicon, 2014, 84（12）: 56-64.

[5]Matsushita K, Wu Y, Qiu J, et al. Fas receptor and neuronal cell death after spinal cord ischemia [J]. J Neurosci, 2000, 20（18）: 6879-6887.

[6]Cepero E, King AM, Coffey L M, et al. Caspase-9 and effector caspases have sequential and distinct effects on mitochondria [J]. Oncogene, 2005, 24（42）: 6354-6366.

[7]Snigdha S, Smith E D, Prieto G A, et al. Caspase-3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death [J]. Neuroscience Bulletin, 2012, 28（1）: 14-24.

[8]程 钢, 秦媛媛, 程 迪, 等. 氧化苦参碱对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及其抑制凋亡的作用机制[J]. 中国药理学通报, 2013, 29（3）: 387-392.

[9]Zhou L, Bondy S C, Jian L, et al. Tanshinone IIA attenuates the cerebral ischemic injury-induced increase in levels of GFAP and of caspases-3 and -8 [J]. Neuroscience, 2015, 288: 105-111.

[10]刘 杰, 刘金之, 林 艳, 等. 超时间窗溶栓治疗对大鼠急性脑梗死后自由基活性和Caspase-3表达的影响[J]. 山东大学学报(医学版), 2015, 53（4）: 26-30.

[11]庄 严, 王丹丹，柳忠兰，等. 吸烟对大鼠局灶性脑缺血后Caspase-3表达及细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志, 2014, 34（1）: 156-158.

[12]Lalier L, Cartron P F, Juin P, et al. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis [J]. Apoptosis, 2007, 12（5）: 887-896.

[13]宋先红, 况时祥. 脑通汤对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡基因Bcl-2、Bax及Bcl-2/ Bax 比例变化的影响[J]. 时珍国医国药, 2014, 25（11）: 2567-2570.

[14]Cho Y S，Shin M S，Ko I G，et al. Ulinastatin inhibits cerebral ischemia-induced apoptosis in the hippocampus of gerbils [J]. Mol Med Rep, 2015, 12（2）: 1796-1802.

[15]邢变枝, 陈 晖, 王 磊, 等. 缺血后处理对脑缺血再灌注损伤后Caspase-3、Caspase-9激活和细胞色素C释放的影响[J]. 临床误诊误治, 2013, 26（8）: 76-79.

[16]刘庆杰, 白宏英, 刘春岭, 等. 乌司他丁对脑缺血-再灌注大鼠脑组织细胞色素C、凋亡诱导因子表达及凋亡细胞数的影响[J]. 临床神经病学杂志, 2012, 25（1）: 40-42.

[17]Huang X P，Tan H，Chen B Y，et al. Astragalus extract alleviates nerve injury after cerebral ischemia by improving energy metabolism and inhibiting apoptosis [J]. Biol Pharm Bull, 2012, 35（4）: 449-454.

[18]Zheng W, Niu L, Zhang C P, et al. Brain edema and protein expression of c-Fos and c-Jun in the brain after diffused brain injury [J]. Int J Clin Patho, 2014, 7（6）: 2809-2817. [19]毛晓霞, 夏爱华, 吴晓光, 等. 山楂叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡和c-fos，c-jun表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2015, 21（2）: 174-177.

[20]Gudkov A，Komarova E A. Pathologies associated with the p53 response [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2010, 2（7）: 1180-1185．

[21]Vaseva A V, Marchenko N D, Ji K, et al. p53 opens the mitochondrial permeability transition pore to trigger necrosis [J]. Cell, 2012, 149（7）: 1536-1548.

[22]Cui D R, Wang L, Jiang W, et al. Propofol prevents cerebral ischemia-triggered autophagy activation and cell death in the rat hippocampus through the NF-κB/p53 signaling pathway [J]. Neuroscience, 2013, 246: 117-132.

[23]颜 玲, 黄德彬, 刘锦红, 等. 黄芪多糖对脑缺血再灌注大鼠脑皮质中HSP70、PKB和P53 蛋白表达的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2012, 28（9）: 1610-1617.

[24]Filichia E, Shen H, Zhou X, et al. Forebrain neuronal specific ablation of p53 gene provides protection in a cortical ischemic stroke model [J]. Neuroscience, 2015, 295: 1-10.

[25]Sims N R, Muyderman H. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke [J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1802（1）: 80-91.

[26]张素芬, 阴怀清, 常 霞, 等. 神经生长因子对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后脑组织Fas/FasL表达的影响[J].中国药物与临床, 2010, 10（4）: 391-393.

[27]Xu J J, Guan D, Zhu W J, et al. Estrogen inhibits Fasmediated apoptosis in experimental stroke [J]. Exp Neurol, 2009, 215（1）: 48-52．

[28]杨小霞，李国前，王杰华，等. 丁苯酞对大鼠急性脑缺血再灌注后Fas与FasL表达的影响[J].中国临床药理学杂志, 2014, 30（7）: 588-590.

（2015-06-30收稿 2015-09-21修回）

（责任编辑 付 辉）

Research progress of apoptosis related factors on the underlying mechanism of stroke

ZHAN Yuhao1, SHEN Junming1, WANG Zhihui2, WANG Yafei1, and ZHANG Wenli2. 1. Acupuncture and Massage Specialty，College of Traditional Chinese Medicine, 2. Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000，China

Stroke is characterized by the sudden loss of cerebral blood circulation. In the pathology course of stroke, dynamic expression and regulation of apoptosis related factors in brain have become an important direction of current research in the field of neurology. The author reviewes related literatures and summerizes important effects and underlying mechanism of apoptosis family on stroke, such as Caspases protein family, Bcl-2 protein family, cytochrome complex(cyt-c), early response gene c-fos, p53 gene and Fas gene.

apoptosis related factors; stroke; underlying mechanism究表明[2,3]，细胞凋亡是细胞自发引起的死亡过程，其过程受严格程序的基因调控，又被称为细胞程序性死亡，在清除机体衰老细胞、维持机体正常生理平衡以及多种疾病过程中起着非常重要的作用。在诸多凋亡相关因子中，Caspases蛋白家族是细胞凋亡的主要的执行者，Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡信号转导的主要调节者，cyt-c从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤，即早反应基因c-fos是细胞对缺血反应的敏感标志之一，p53基因，Fas基因是脑卒中后的关键调控因子。利用凋亡相关因子的作用机制对脑卒中进行干预治疗，是当今脑卒中研究的重要方向与途径。笔者综述了脑卒中病程发展过程中细胞凋亡相关因子发挥的作用及其影响机制。

R743.3

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.10.015

大学生创新创业计划项目（校级编号x2014008，省级国家级编号201410081030）；河北省中医药局项目（2014058），唐山市科技局项目（13130293z）；国家科技部老年医学国际科技合作基地项目（14160201B）；唐山市老年医学重点实验室项目（14140221B）

詹宇豪，本科在读，E-mail： 815152835@qq.com

063000 唐山，华北理工大学：1.中医学院针灸推拿专业，2.医学实验研究中心

张文丽，E-mail： dianj@163.com